Sales: 021-88224007
0

فرمول كلي محاسبه سلول برای یک چاهک

فرمول كلي محاسبه سلول برای یک چاهک

                  Requirement                                                 Stock

)    cell line (مقدار مورد نياز                                     (مقدار موجود از سلول) 

Concentration of cells you need× final volume =  Concentration of cell in stock  × volume that you have to take from stock

 

نكته: بايد دقت داشت كه غلظت Stock بیش از Requirement باشد. همچنين واحدها يكسان باشند.

نمونه سوال

فلاسك T25 حاوی 3 ميليون سلول است. سلول‌­ها تریپسینیزه و در  ml5 محیط کشت حل می‌شوند. اگر بخواهیم 50 هزار سلول را در هر خانه پليت 24 خانه‌ای بریزیم و محیط کشت نهایی آن رابه  ml1 برسانیم، چه حجمی از ml5 را باید برای یک خانه استفاده کنیم؟

5 x 104cell/ml × 1ml = 3 x 105 cell/ml x X

x = 0.083 mL = 83µl

بنابراین، باید lµ 83 را به حجم ml1 رسانید و آن را در یک خانه از پلیت قرار دهید.

پاساژ-نامبر (Passage Number)

هنگامي كه تعداد سلول در ظرف كشت به 80-75%  رسيد، باتوجه به اندازة ظرف و رشد سلول­‌ها به چند (X) ظرف تقسيم می­‌شوند. این تقسیم اول پاساژ-نامبر 1 نام دارد. اگر باز هر یک از اين ظروف به ظروف ديگر تقسيم شود، تقسیم پاساژ-نامبر 2 نامیده می­‌شود و به همین ترتيب ادامه می­‌يابد. پاساژ نامبر معمولاً روی شناسنامه سلول در بانك سلولی ذكر می‌شود.

پيری در اثر همانندسازی (Replicative senescence or Hayflick’s limit)

اولين دانشمندی كه متوجه شد سلول­‌های فيبروبلاست پس از پیشروی تا چند پاساژ، ديگر شرايط روز اول را ندارند، رشد نمي‌كنند و می‌ميرند، هیفلیک بود. البته فاز ثابت Staturation در هر سلولی وجود دارد، اما در اينجا ديگر سلول تقسيم نمی‌شود. این فرایند اصطلاحاً سلول پير می‌شود. هیفلیک متوجه شد كه سلول­‌های سوماتيك (غير بنيادی) كه در آن­ها تلومراز فعاليتی ندارد، در تكثير محدود هستند مثلا پس از 60 بار تكثير ديگر تكثير نمی‌شوند. كه اين محدوديت يا ماكزيمم طول عمری كه سلول­‌ها را می‌توان در محيط كشت نگه‌­داشت پيری سلول یا Senescent) (Hayflick’slimit گويند.

عوامل بروز پيری سلول در شرايط In vitro

ـ  قرار گرفتن سلول در شرايط استرس (stress) مثل شرايطی كه سلول‌­ها بيش از اندازه كنار هم باشند، فضا برای آن­ها کم باشد و محيط مغذی به آن­ها نرسد يا مواد سمی توليد كنند.

ـ كوتاه شدن تلومر

تلومر قسمتي از DNA در انتهای كروموزم است. (دو جفت تلومر در هر كروموزوم وجود دارد كه از انتهای كروموزوم محافظت می‌كنند.)

شکل 1-11 محل قرارگيری تلومر در انتهای کروموزوم

در هر بار تقسيم كروموزوم، كمي از تلومرها كوتاه می‌شود تا زمانی ­كه سلول به مرحله بحرانی وارد شده و پيری اتفاق می‌افتد. اگر ژن بیان­‌کننده آنزيم تلومراز وارد ژنوم سلول شود، از پيری سلول جلوگیری می‌شود (يكی از روش‌­های نگه­داری يا ميراسازی سلول).

به‌­طور كلي طول تلومر مانند يک ساعت بيولوژيکی عمل می‌کند و کوتاه شدن آن تا حد مشخصی ادامه می­‌یابد. هنگامی­كه طول تلومر به حد بحرانی برسد، سلول ديگر نمی‌تواند تکثير شود. در سلول‌های توموری طول تلومر با تلومراز افزايش می‌­يابد. این جریان مانع از پيری سلول­‌ها می‌­شود.

نكته: آنزيم تلومراز به‌­صورت طبيعی در سلول­‌های سوماتيك سركوب شده است، ولی در سلول­‌های سرطانی به‌­صورت غير معمول فعال می‌­شود و سلول همانند يک انكوژن عمل می‌­کند.

تغييرات احتمالی با افزايش پاساژ نامبر در سلول

– تغيير در مورفولوژی سلول (بزرگ یا عریض شدن سلول)

– تغيير در پاسخ سلول به تحريكات (معمولاً پاسخ سلول كاهش می‌یابد).

– تغيير در ميزان رشد سلول: افزايش زمان دوبرابر شدن سلول (PDT) در مقایسه با حالت عادی (24 ساعت به بالا)    

– تغيير در بيان پروتئين

– تغيير در ترانسفكشن و سيگنالينگ

تکنيک­‌های گندزدايی (Aseptic technique)

با وجود آنتی‌­بيوتيک‌­ها، آلودگی­‌های ناشی از لاشه­‌های ميکروارگانيسم‌­ها (باکتری‌­ها، مايکوپلاسما، مخمر و يا اسپور قارچ) در کشت سلول بسیار مهم است. اين آلودگی­‌ها همراه آزمايشگر یا از راه هوا، سطوح کار و محلول­‌ها به محيط کشت وارد می­‌شود و ممکن است يک يا دو کشت سلولی يا همه محيط آزمايشگاه را آلوده کند. با رعايت اصول زیر می‌­توان از میزان آلودگی کشت سلول کاست:

  • بررسی مکرر محيط کشت از نظر آلودگی با ميکروسکوپ فاز کنتراست.
  • آشکار­سازی آلودگی­‌های پنهان محيط کشت با نگه­داری مدت زمان کوتاهی بدون آنتی­‌بيوتيک در دمای 37 درجه سانتی‌گراد
  • انحصار ظروف کشت به آزمايشگر و يا يک تيره سلولی
  • اطمينان از استريل بودن بافرهای مورد استفادة توليد­کننده يا آزمايشگر
  • حفظ تکنيک‌­های استاندارد استريليتی در زمان انجام کار

تشخيص آلودگی­‌های مايکوپلاسمايی با ميکروسکوپ معمولی ممکن نيست. این آلودگی­‌ها اگر تشخیص داده نشوند، آزمايشگاه و کشت‌های ديگر را آلوده می­‌کند. بنابراين، پیش از شروع کار به‌ويژه در مورد سلول­‌هايی با رشد غير­طبيعی، تست مايکوپلاسما ضروری است.

تکنيک گندزدايی سدی را بين ميکروارگانيسم­‌های موجود در محيط بيرون کشت و محيط کشت عاری از آلودگی درون ظرف آزمايش يا فلاسک تولید می­‌کند. از اين رو بايد همه موادی که در تماس مستقيم با کشت سلول‌­اند استريل شوند. به صورتی که ارتباطی بين کشت سلول با محيط غير استريل وجود ندشته باشد.

اگرچه امروزه شرايط آزمايشگاه­‌های مدرن بهبود يافته است (کولر، فيلتر، هود لامينار و … )، در این مکان­‌ها ازدحام جمعيت بيشتری دیده می‌­شود و این امر حفظ استريليتی در آن­ها را بسيار مشکل می­‌کند.

جدول 1ـ8 ـ تکنيک مناسب گندزدايی.
GOOD ASEPTIC TECHNIQUE
DO DON’T
Glassware Keep stocks separate(blue caps) Use for chemmical
Laminar flow hoods Book Overbook & not use
Keep minimum in hood Culture up the hood
Swap down before and after Leave it in a mess
Contamination Work without antibiotics if possible Open contaminated flasks in tissue culture
Box open plates Leave contaminations unclairned
mycoplasma Test cell routinely Carry infected cells
Try to decontaminate
Importing cell lines Check for mycoplasma
Validate origin
Keep records
Exporting cell lines Check for mycoplasma
Validate origin
Send data sheet
Triple wrap
Flasks Vent briefly if stacked Stack too high
Pipettes Use plastic for agar Overfill hods

جداسازی سلول‌­ها برای کشت اوليه 

کشت اوليه را برای تهيه تيره‌های سلولی استفاده می‌کنند که از بافت‌­های مختلف بدن جاندار يا جنين گرفته می­‌شود. به دليل تمايزيافتگی کمتر سلول‌­های جنينی بهتر است از جنين برای کشت اوليه استفاده شود. به اين منظور مراحل تهيه سلول‌ها برای کشت اوليه از جنين موش، جنين مرغ و در مورد انسان از طريق بيوپسی بافت مورد نظر شرح داده می‌شود.

مراحل جداسازی جنين موش برای کشت اوليه

1-  موش­‌های نر و ماده را به منظور جفت­گيری در يک قفسه قرار می­‌دهیم، برای اطمينان از جفت­گيری موفق هر صبح موش‌های ماده معاينه واژينال پلاک می‌­شوند. وجود موکوس سفت اطراف دهانه واژن نشان‌دهنده حاملگی است. روز تعيين پلاک روز صفر در نظر گرفته شده و از اين روز به بعد تکامل جنين آغاز می­‌شود. حدود 20-19 روز بعد دوره آبستنی کامل می­‌شود. روز مناسب برای جداسازی جنين از رحم مادر روز سيزدهم آبستنی است در اين زمان بخش زيادی از مزانشيم تمايزنيافته و بيشترين سلول کشت از آن به دست می‌­آيد. (بيشتر اندام‌­ها به جز قلب و مغز روز نهم آبستنی می­‌گیرد اما تا روز يازدهم نمی‌­توان آن­ها را جدا کرد. به طور­کلی موش را در روز سيزدهم و چهاردهم راحت­‌تر می‌­­توان تشريح کرد. اندام­‌ها تا روز هجدهم کاملاً شکل گرفته­‌اند.)

2- موش‌­ها را با کشيدگی (جابجايی) گردن کشته و سطح شکمی را با الکل 70%  تميز می­‌نماییم، پوست شکم را به صورت افقی در خط ميانی بالای ديافراگم پاره کرده سپس پوست هر دو سمت پارگی را گرفته و به سمت مخالف می‌کشیم تا ديواره شکمی دست­‌نخورده نمايان شود.

شکل 1ـ12ـ مراحل برداشتن آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: ضدعفونی کردن شکم موش
شکل 1ـ13ـ مراحل برداشتن آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: پارگی پوست
شکل 1ـ14ـ مراحل برداشتن آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: پارگی پوست برای نمايان‌سازی ديواره شکمی

3- با قيچی استريل در امتداد خط ميانی برش طولی داده تا احشا آشکار شوند. در اين مرحله رحم پر از جنين از پشت مشخص است. قطعات را درون يک تيوب درب­دار 50-25 ميلی‌ليتری حاوی 20-10 ميلی‌ليتر BSS وارد نموده (در صورت احتمال آلودگی می‌­توان به BSS آنتی بيوتيک اضافه کرد.) و درب آن را می‌­بندیم.

شکل 1ـ15ـ مراحل برداشتن آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: باز کردن شکم
شکل 1ـ16ـ مراحل برداشتن آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: پيدا کردن رحم
شکل 1ـ17ـ مراحل برداشتن آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: برداشتن رحم

همه مراحل بالا بايد بيرون از آزمايشگاه کشت انجام شود. يک هود لامينار کوچک و تکنيک سريع به نگه­داری استريليتی کمک می­‌کند. حيوان زنده در آزمايشگاه کشت برده نمی‌شود. تکه بافت حيوان را پس از غوطه‌ورسازی در الکل بعد از استفاده به سرعت دور می­‌ریزیم.

4- رحم سالم را به آزمايشگاه کشت برده و به يک ظرف استريل­‌شده با BBS انتقال می‌دهیم.

5- تشريح جنين (شکل 1-18 و 1-19). با دو پنس استريل رحم را پاره می­‌کنیم. برای جلوگيری از پيچش رحم و فشار بر جنين دو لبه پاره­‌شده را نزديک هم نگه می­‌داریم. جنين­‌ها را از جفت جدا کرده و در يک سمت ظرف قرار می­‌دهیم. سپس، آنها را به ظرف ديگری منتقل می­‌نماییم. در­صورتي­که به تعداد زيادی جنين نياز باشد (بيش از 4 يا 5 نوزاد در يک زايمان)، بهتر است ظرف حاوی جنين­‌ها برای تشريح و کشت بعدی روی يخ قرار داده شود.

پس از ريز­ريز­ کردن (Chopping) با چاقوی شماره 11 جراحی، به کمک آنزيم يا به صورت مکانيکی سلول­‌ها را جدا کرده و کشت می‌­دهیم.

شکل 1ـ18ـ مراحل برداشتن آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: تشريح جنين از رحم
شکل 1ـ 19ـ مراحل برداشت آسپتيک جنين موش برای تهيه کشت اوليه: از بين بردن پرده‌ها و ريزريز کردن جنين

مراحل جداسازی جنين مرغ برای کشت اوليه

1- تخم­‌مرغ را در دمای 38.5 درجه سانتي­‌گراد در هوای مرطوب انکوبه کرده و تخم‌­مرغ هر روز 180 درجه چرخانده می‌شود. اگر­چه حدود روز 21-20 جوجه به دنيا می‌­آيد اما طول مراحل تکاملی آن با موش متفاوت است. برای کشت اوليه سلول­‌های جدا شده از جنين تخم‌­مرغ، بهتر است نمونه سلولی در روز هشتم گرفته شود. اما جداسازی اوليه اندام در روز دهم تا سيزدهم انجام می­‌شود.

2- انتهای بالايی تخم‌­مرغ را با الکل 70% ضدعفونی نموده و سپس آن را روی يک بشر کوچک قرار می­‌دهیم.

شکل 1ـ20ـ مراحل آسپتيک برداشتن جنين از تخم‌مرغ: ضدعفونی کردن تخم‌مرغ

3- پوستة نوک تخم‌­مرغ را می‌شکافیم و با استفاده از پنس پوسته را برداشته تا پرده سفيد زيری نمايان شود.

شکل 1ـ21ـ مراحل آسپتيک برداشتن جنين از تخم‌مرغ: شکافتن پوسته

4- پنس را با قرار­دادن در BSS استريل یا فروبردن مجدد در يک بشر الکل استريل­ کرده و پرده سفيد زير پوسته را برمی­‌داریم تا پرده کوريوآلانتوئيک با عروق خونی آن نمايان شود.

شکل 1ـ 22ـ مراحل آسپتيک برداشتن جنين از تخم‌مرغ: جدا کردن پرده سفيد زير پوسته
شکل 1ـ23ـ مراحل آسپتيک برداشتن جنين از تخم‌مرغ: برداشتن پرده سفيد برای نمايان شدن پرده کوريوآلانتوئيک

5- پرده کوريوآلانتوئيک را با نوک خميده استريل یک پنس سوراخ کرده و زیر گردن جنين را گرفته و به آرامی بيرون می­‌کشیم. باید دقت شود پنس بسته نشده و به گردن جنين فشار نياورد.

شکل 1ـ24ـ مراحل آسپتيک برداشتن جنين از تخم‌مرغ: سوراخ کردن پرده کوريوآلانتوئيک
شکل 1ـ 25ـ مراحل آسپتيک برداشتن جنين از تخم‌مرغ: برداشتن جنين از تخم‌مرغ و قرار دادن آن در پتری‌ديش

6- جنين برای تشريح و کشت به يک پتری‌ديش 9 سانتی­‌متری حاوی 20 ميلی‌­ليتر DBSS (Dissection BSS) انتقال داده می‌شود. بعد از ريز­ريز کردن (Chopping) به کمک آنزيم يا به صورت مکانيکی سلول­‌ها را جدا کرده و کشت می‌­دهیم. (DBSS: همان BSS  با غلظت u/ml 200 آنتی‌بيوتيک پنی­سیلین و استرپتومایسین)

شکل 1ـ26ـ مراحل آسپتيک تشريح جنين از تخم‌مرغ: جداسازی سر از بدن جنين در پتری‌ديش و در نهايت جداسازی اندام‌های مختلف برای تهيه سلول برای کشت اوليه

مراحل جداسازی بافت انسان برای کشت اوليه

برای تهيه سلول­‌های اوليه از بافت انسانی باید نمونه‌­برداری صورت گيرد. اين کار مستلزم جلب موافقت 1- کميته اخلاق بيمارستان 2- اساتيد جراح 3- بيمار يا بستگان بيمار است. نمونه­‌برداری فقط برای اهداف تشخيصی صورت می­‌گیرد. از اين­رو، بايد در ابتدا يک پاتولوژيست آن را ببيند. در مورد بافت­‌های غير پاتولوژيکی مانند جفت يا بند ناف به این کار نيازی نيست. انتقال نمونه گرفته‌­شده به آزمايشگاه، دريافت نمونه، گزارش جزئيات نمونه باید طبق برنامه‌­ای منظم صورت گيرد تا بافت فاسد از بين نرود. بهتر است نمونه بافتی در هود کلاس دو قرار داده شود و همه لوازم کار با اتوکلاو کردن يا فرو بردن در يک ماده ضدعفونی مناسب استريل شوند. در صورت امکان نمونه بافتی از لحاظ عفونت‌هايی مانند هپاتيت، ايدز، سل و … غربال شود مگر اينکه بيمار نمونه‌دهنده، قبلاً آزمايش داده باشد.

مراحل جداسازی به صورت زیر است:

1-  ظرف حاوی محيط کشت را با درج نام و نشانی آزمايشگر آماده نموده و نمونه بافتی را پس از جراحی درون آن قرار می‌دهیم.

2- نمونه را به آزمايشگاه کشت سلول انتقال می‌­دهیم. در صورت نگه­داری نمونه­‌ها در دمای 4 درجه سانتی‌­گراد بافت به مدت حداقل 24 ساعت زنده می­‌ماند. هر­چه زمان نمونه‌برداری تا کشت بيشتر باشد، شانس زنده بودن بافت کاهش می­‌يابد.

3- گرچه عمل جراحی فرايندی استريل می‌­باشد، پیش از نمونه­‌برداری به بيمار آنتی­بيوتيک خوراکی داده و محل نمونه‌برداری با ماده ضدعفونی شسته می­‌شود. اين کار به‌خصوص برای نمونه­‌برداری از بافت­های کولون و رکتال يا پوست لازم است.

چنانچه نمونة بافتی گرفته‌شده بزرگ باشد (mg 200 يا بيشتر)، به مدت کوتاهی (30 ثانيه تا يک دقيقه) در الکل 70% فروبرده می‌­شود تا آلودگی‌های سطحی کاهش يابد.

 

در نهايت برای شناسايی سلول جدا­شده با تکنيک‌­هاي زير نشان­دار و مشخص می‌شوند:

1- MACs (Magnetic activating cell sorting)  مثل CD133

2- FACs (Fluoresnt actinating cell sorting) مثل SSEA4

3- انتخاب محيط اختصاصی براي رشد سلول مورد نظر مانند کراتينوسيت که از محيط KGM (keratinxyte growth medium) استفاده می‌شود.

شکل 1ـ27ـ حاصل کشت اوليه سلول‌های سنگ‌فرشی کارسينومای ريه انسان را نشان می‌دهد. (سمت راست نمای نزديک سلول‌های کشت داده شده)

جداسازی سلول های بافت برای کشت اوليه در  In vitro

پس از قطعه‌­قطعه کردن بافت، سلول­‌های آن را به کمک روش مکانيکی مانند عبور دادن قطعات بافت از الک‌­های پلاستيکی استريل (شکل 1ـ 27) يا روش آنزيمی با آنزيم‌های پروتئوليتيک مانند تريپسين، کلاژنازI ، کلاژنازIV و ديسپاز آزاد می‌­کنیم و درون ظرف کشت يا فلاسک کشت می‌­دهیم.

شکل 1ـ 28ـ الک يا صافی يک‌بار مصرف از جنس پلی پروپيلن و تيوب برای جمع‌آوری سلول‌های الک‌شده از سوسپانسيون اوليه سلول يا بافت نرم.

این مطلب را پسندیدید؟

-

به اشتراک بگذارید

Share on facebook
Share on twitter
Share on linkedin
یک پاسخ بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.فیلد هایی که با علامت ستاره 8 مشخص شده اند، الزامی هستند

[wp-reviews]
X