Sales: 021-88224007
0

محیط کشت

محيط کشت

محيط­‌های کشت بافرهای متفاوتی براي حفظ و نگهداری pH دارند. معروف‌ترين بافرها بی‌کربنات و PBS است.

اگر co2 محيط انکوباتور کم باشد، اسيد کربنيک محيط کشت تجزيه شده و co2 آزاد می­‌شود که این واکنش محيط را قليايی می­‌کند و فنل­رد به رنگ ارغوانی پر­رنگ­تر از محيط معمولی درمی‌­آيد. اگر محيط کشت اسيدی شود، فنل­رد محيط کشت به رنگ زرد در می‌آيد.

 اگر محيط کشت به رنگ زرد کدر درآید، نشانه آلودگی محیط با باکتری است.

يک محيط استاندارد در (Optimize) PH=7/4 قرمز يا ارغواني روشن است. در محيط اسيدی زرد رنگ و هر­چه pH افزايش می‌يابد ارغوانی می‌شود.

توجه: در صورت وجود چند فلاسک از يک محيط کشت، بهتر است همه آن­ها از نظر تغيير pH  کنترل شوند تا در صورت آلودگی از بقيه جدا شوند.

جدول 1ـ4ـ تغيير رنگ محيط کشت حاوی فنل­رد در pH مختلف:
pH رنگ محيط کشت
7/7 ارغوانی
6/7 قرمز متمايل به آبی
4/7 قرمز
7 نارنجی
5/6 زرد

چهار نوع عمده کشت سلول

1-کشت عضو : (organ culture) بافت از یک طرف در محيط کشت غوطه­‌ور است و از طرفی به طور مستقيم تبادل گاز انجام می‌­دهد. اين وضعيت باعث حفظ خصوصيات بافتی عضو مورد نظر می‌شود (شکل 1-6). اين روش به دليل مشکلاتی نظير عدم اکسيژن­‌رسانی و تغذيه مناسب سلول­­‌های درون بافت استفاده چندانی ندارد. و تنها جهت نگهداری بافت در مدت زمان کوتاه استفاده می‌­شود. برای رفع اين مشکل، بافت را می­توان در سيستم­‌هايی (بيوراکتورهايی) مثل بطری غلطان يا اسپين­دار کشت داد.

2-کشت سلول اوليه (Primary calture or explants culture) : در اين حالت سلول­‌های جدا شده از بافت­های بدن جنين يا جاندار زنده، در ظرف کشت، کشت داده می‌شود به صورتي­‌که کاملا در محيط کشت قرار گيرند. اين نوع کشت به نام کشت اوليه انجام می­‌گيرد (شکل 1ـ6).

3-کشت سلول جدا شده (Dissociated all culture): در اين روش کشت، سلول­‌هاي جدا­شده به صورت تکه‌­لايه روی سطح جامد رشد مي‌نمايند (شکل 1ـ6). اين نوع کشت بيشتر در آزمايشگاه­‌های تحقيقاتی انجام می‌­شود و نوع معمول کشت سلول است.

4- Organotypic culture: هم‌­کشتی دو يا چند نوع سلول در کنار يکديگر را گويند (شکل 1ـ6).

شکل 1ـ6 ـ چهار نوع کشت سلولی معمول عضو، کشت اوليه، کشت سلول جدا شده و کشت ارگانوتيپيک.

منابع بافتی برای کشت سلولی

برای کشت سلول می‌­توان از هر دو نوع سلول­‌های بافت‌های جنينی و بالغین استفاده کرد. بافت‌های جنينی به علت عدم تمايز کامل و وجود سلول‌های بنيادی عمر بيشتری داشته و بهتر رشد می‌کنند، در حالي­که سلول‌­های بالغین قدرت تکثير و عمر کوتاه­‌تری دارند.

 نمونه­‌هايی از تيره‌­های سلولی جنينی، که کاربرد زيادی دارند 3t3 (فيبروبلاست­‌های جنينی موش)،  MRC-5  (فیبروبلاست ریه انسان) و فيبروبلاست­‌های ريه جنين انسان می­‌باشند.

کشت سلول­‌های بالغين از نظر منشأ جنينی با هم متفاوت است. سلول­‌های مشتق از بافت­‌های مزودرمی (فيبروبلاست­‌ها، اندوتليوم و ميوبلاست­‌ها) بهتر و راحت‌­تر از سلول­‌های مشتق از بافت­‌های اندودرمی (سلول­‌های اپيتليال) و اکتودرمی (نورون­ها) کشت می­‌شوند و به فاکتورهای ميتوژنيک سرم بهتر پاسخ می‌­دهند. تجربه نشان می‌­دهد فاکتورهای سرم موجب مهار رشد و تمايز سلول­‌های اپيتليال می‌­شود.

جدول 1ـ 5 ـ نمونه‌­هايی از مهمترين تيره­‌های سلولی چسبنده.
نام تيره سلولی بافت منشأ مورفولوژی
MRC-5 ريه انسان فيبروبلاست
Hela گردن رحم انسان اپی­تليال
VERO کليه ميمون سبز آفريقايی اپی­تليال
NIH3T3 جنين موش فيبروبلاست
L929 بافت همبند موش فيبروبلاست
CHO تخمدان همستر چينی فيبروبلاست
BHK-21 کليه همستر سوريه‌­ای فيبروبلاست
HEK293 کليه انسان اپی­تليال
HEPG2 کبد انسان اپی­تليال
BAE-1 آئورت گاو اندوتليال
جدول 1ـ6 ـ  نمونه­‌هايی از مهمترين تيره‌­های سلولی شناور.
نام تيره سلولی بافت منشأ مورفولوژی
NSO ميلوم موش شبه لنفوبلاستوئيد
U937 لنفوم هيستيوسيت انسان لنفوبلاستوئيد
Namalwa لنفوم انسان لنفوبلاستوئيد
HL60 لوسمی انسان شبه لنفوبلاستوئيد
WEHI231 لنفوم سلول­‌هایB موش لنفوبلاستوئيد
YAC1 لنفوم موش لنفوبلاستوئيد
U266B1 ميلوم انسان لنفوبلاستوئيد
SH-SY5Y نوروبلاستوم انسان نوروبلاست

سینتيک رشد سلول

در استانداردسازی مطالعات کشت سلولی شناسايی خصوصيت رشد تيره سلولی مورد مطالعه و تهيه منحنی رشد آن لازم است. این عوامل اطلاعات مفيدی درمورد فواصل پاساژ سلولی و تعداد سلول­‌ها در هر پاساژ را در اختيار ما قرار می­‌دهد.

منحنی رشد چيست؟

نامگذاري اين منحني به منحني رشد به اين دليل است كه بعد از گذشت معمولا 48 ـ 24 ساعت از كشت سلول در ظرف (زمان دوبرابرشدن)، سلول­‌ها تكثير می­‌یابند.

شکل 1ـ 7 ـ منحنی نيمه لگاريتمی رشد سلولی فاز نمايی. در اين شکل فاز تأخير Lag است. فاز نمایی Log و فاز کفه که نشان‌دهنده نياز به Subculture و Feeding است.

ابتدای منحنی فاز Lag (فاز تأخير) است كه در آن هنوز تعداد سلول­‌ها زياد نشده است. در این فاز تعداد سلول­‌های تکثير­يافته با تعداد سلول­‌های مرده برابر است. با گذشت زمان سلول­‌ها تكثير می‌یابند.این فاز را Log می‌نامند. سپس سلول‌­ها وارد فاز سکون می‌­شوند. اين رخداد هنگامی است  که ظرف كشت پر شده (Contact inhibition) و سلول‌ها جايی برای تكثير ندارند. همچنين ميزان مواد غذايی به حداقل رسيده است. البته این وضعیت در مورد سلول‌­های سرطانی صدق نمی‌كند، چون سلول­‌های سرطانی می‌توانند بر روي یکديگر تكثير يابند، در­واقع اين سلول­‌ها Contact inhibition  ندارند. بعد از فاز سکون، به­‌دليل تجمع مواد متابوليتی و کاهش مواد مغذی محيط، سلول­‌ها از بين می‌­روند.این فاز را فاز نزولي يا  Decline گويند.  

فوايد منحنی رشد

1- تعيين زمان اضافه كردن محيط كشت و پاساژ دادن (Subculture)

نكته: Subculture همان پاساژ دادن سلول است. در مورد سلول­‌های چسبنده آن­ها را از كف ظرف کشت جدا كرده، به‌صورت سوسپانسيون سلولی به يك يا چند ظرف ديگر منتقل مي‌­كنند.

2- تعيين کیفیت سرم، محيط يا فاكتور رشد اضافه شده به محيط كشت سلول با کمک منحني رشد.

سؤال: آيا مي‌توان در زمان دلخواه (هر 4 ساعت يك­بار) به سلول­‌ها سرم و مواد مغذی اضافه كرد؟

چون سلول در محيط كشت شرايط و محيط جديد جدا از بدن را تجربه می‌كند، برای شناسايی خود و محيط اطرافش به زمان نیاز دارد. از اين رو، به سلول در محيط كشت به مدت 5-4 روز چيزی اضافه نمی‌­شود تا خود سلول برای سازگاری با محيط اطرافش شروع به توليد مواد محرك تكثير كند. البته اين زمان به نوع سلول بستگی دارد. بعد از اين مدت زمان، همه یا بخشی از محيط قبلي خارج و محيط جديد به آن اضافه مي‌شود.

 از موارد شایان توجه هنگام کشت سلول، درنظر­گرفتن تاریخ انقضای (Lot number) سرم و محيط كشت است. درصورتی­که این تاریخ گذشته باشد، سلول‌­ها به‌­خوبی رشد نمی‌­کنند و حتی در صورت رشد، تغییر ماهیت می‌­دهند.

در 5 ـ4 روز اول ميزان محيط اضافه‌­شده به كشت به ظرف كشت بستگی دارد. مثلاً به فلاسك محيط اضافه می‌شود. و به‌­طور­مثال 10-8 میلی‌لیتر به فلاسک T25 و 20 میلی‌لیتر به فلاسک T75 محیط اضافه می‌شود.

برای بقای سلول­‌ها در کشت اولیه سلول، انتخاب ظرف و تعداد سلول کشت‌­یافته بسیار مهم است. تحقیقات نشان داده است که سلول­‌ها برای بقا به برهم‌­کنش با یکدیگر ازطریق پیام­‌رسانی (انتقال سیگنال) نیاز دارند و دور­ بودن آن­ها از یکدیگر می­تواند باعث آپوپتوز شود. البته این موضوع در همه سلول­‌ها صدق نمی­‌کند.

زمان پاساژ دادن: بسته به نوع سلول 5-4 روز تا يك هفته بعد از Feeding و پیش از رسیدن به فاز ثابت  Saturation، باید پاساژ را شروع كرد (زماني كه سلول ها 80%- 75% ظرف كشت را اشغال كرده‌­­اند.)

برای تشخيص اين­که سلول هنگام کشت به سلول سرطانی تغيير يافته  يا خصوصيت خود را حفظ کرده است، آگاهی از زمان رسيدن به فاز سکون Saturation Density مهم است.

در منحنی رشد زمان دو برابر شدن سلول (PDT) محاسبه می­‌شود و سلول ترانسفورم‌شده cell) (Transformed در مقایسه با سلول نرمال در زمان طولانی­‌تری به فاز ثابت (Saturation density) می‌رسد.

مثلاً اگر زمان دو برابر شدن معمول يك نوع سلول 16 ساعت باشد و در حين کشت به 24 ساعت برسد، ممکن است آن سلول مورد نظر نباشد يا اينكه فاکتوری از محيط كشت كم شده و محیط کشت آلوده شده است. (آلودگي مايكوپلاسمايي كه در ظرف كشت چيزی نشان نمی‌دهد اما زمان دو برابر شدن سلول را افزايش می‌دهد).  

اصطلاحات منحنی رشد

Lang lag : طولانی شدن فاز تأخير، يعنی هنوز سلول­‌ها براي تطابق با محيط کشت و سرم به زمان نیاز دارند.

Short doubling time : كوتاه شدن فاز تكثير، يعني سلول‌­ها سريع رشد می‌كنند. (در زمان كوتاه تعداد بيشتری سلول توليد می‌شود.)

منحنی رشد در عمل (Protocol)

Step1 : سلول­‌های چسبنده كشت داده در فلاسك  T75 با تريپسين يا Cell Scraper  جدا می‌شوند. سپس، در لوله فالكون ريخته و سانتريفوژ می‌شوند. سپس 50 هزار سلول در ميلي­ليتر را در هر خانه از پليت‌های 24 خانه منتقل می‌کنند.

شکل 1ـ 8 ـ مراحل اول ارزيابی منحنی رشد.
شکل 1 ـ 9 ـ مراحل دوم محاسبه منحنی رشد سلول.

مطابق شکل 1-9 در لوله فالكون كه 1.6 ميليون سلول در ميلی‌ليتر است، برای انتقال 50 هزار سلول در هر خانه از پليت 24 خانه چنين محاسبه می‌شود.

ml 26  ×  cell/mL  104 × 5 =    x×   cell/mL10× 6/1

حجم سلول به جای 24 خانه برای 26 خانه آماده می­‌شود تا هنگام استفاده كم نيايد.

µL 800 یا mL  8/0  =  X

مقدار سلول بدست‌­آمده در mL 25.2 محيط اضافه می­‌شود.

سپس سوسپانسيون سلولی با پيپتاژ يكنواخت و در هر خانه (چاهک) ريخته و در نهايت در انكوباتور قرار داده می‌شود. در هر رديف چاهک‌­ها (هر پليت 24 خانه 6 رديف چهارتايی دارد.) بر اساس زمان تقسيم‌بندی می‌­شوند بدين صورت كه سلول­‌های رديف اول 24 ساعت، رديف دوم 48 ساعت، رديف سوم 72 ساعت، رديف چهارم 96 ساعت، رديف پنجم 120 ساعت و سرانجام رديف ششم 144 ساعت بعد شمارش می‌شوند. يعنی شمارش بايد در مدت 6 روز انجام شود.

هنگام شمارش سلول­‌ها بعد از 24 ساعت اول محيط رويی رديف اول را برداشته و با PBS شسته می‌شود. چون محيط حاوي FBS است و هنگام جدا كردن سلول از كف پليت FBS تريپسين را غيرفعال می‌كند، بنابراين، با دو تا سه بار شستشو با PBS سرم خارج می­‌شود. سپس، به هر خانه حدود 350 ميكروليتر تريپسين اضافه می‌شود. پس از گذشت سه دقيقه در انكوباتور، 650 ميكروليتر محيط حاوي 10% FBS برای خنثی کردن تریپسین به چاهک­‌ها اضافه می­‌شود. سپس، سلول­‌های هر خانه جداگانه شمارش می‌شوند. اين روند به مدت 6 روز برای 6 رديف از 24 خانه صورت می‌گيرد. با ميانگين گرفتن 4 خانه در هر روز، منحنی رشد همان روز رسم می‌شود (شکل 1ـ10 رسم منحنی رشد با نرم‌­افزار Excel را نشان می‌­دهد).

نكته: اين مراحل براي سلول‌هايی كه سوسپانسيون هستند آسان‌تر است. در این سلول­‌ها چون از تريپسين استفاده نمی‌شود، نياز به شستن با PBS نيست.

جدول 1ـ 7 مثالی از تعداد سلول يک سلول Hela در هر پاساژ سلولی

شکل 1ـ10ـ مراحل ورود اطلاعات در صفحه Excel و رسم منحنی رشد با کمک صفحه Excel

این مطلب را پسندیدید؟

-

به اشتراک بگذارید

Share on facebook
Share on twitter
Share on linkedin
یک پاسخ بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.فیلد هایی که با علامت ستاره 8 مشخص شده اند، الزامی هستند

[wp-reviews]
X