جدول محتوا
تعاريف و اصطلاحات معمول در کشت سلولی
تيره يا رده سلولی (Cell line): جمعيت سلولی هموژنی که از کشت اوليه به دست آمده و شناسنامه مشخصی (ID) در همه آزمايشگاههای دنيا دارد، رده سلولی نامیده میشود. مثلاً رده سلولی Hela که از دهانه رحم خانمی به همین نام جدا شده است.
Cell strain: معمولاً به سلولهايی گفته میشود که حاصل دستکاری ژنتيکی رده سلولی است. مثلاً اگر ژن انسولين وارد ژنوم رده سلولی Hela شود، سلولهای Hela بيانکننده انسولين، کلون یا سوشی از رده سلولی Hela هستند.
Substrate: سطحی از جنس پلاستيک، شيشه يا ماده دیگری که سلول میتواند روی آن بچسبد. سلولها از لحاظ وابستگی به Substrate به دو دسته تقسيم میشوند:
الف) سلولهای وابسته به Substrate (Anchorage – dependent): سلولهای چسبنده مثل HEK293T (سلولهای جنينی کليه انسان)
ب) سلولهای مستقل از Substrate (Anchorage-independent): سلولهای شناور مثل MOLT4 (رده سلولیT لنفوئيدی)
Matrices: ترکيباتی از جنس ماتريکس خارج سلولی (ECM) که ليگاند را برای برهمکنش با رسپتورهای سطح سلول مثل اينتگرين فراهم میکنند. Matrices مثل لامينين، کلاژن نوع IV و… .
Scaffolds: معمولاً پليمرهای زيست سازگار و زيست تخريبپذيرند که برای کشت سه بعدی سلول استفاده میشوند. مثل PLGA و……..
يکی از مشخصههایی که در تقسيمبندی سلولها به کار میرود مورفولوژی يا ريخت ظاهری آنها است. مثالاً سلولهای فيبروبلاست کشيده(دوکی شکل) ولی سلولهای عصبی ستارهای شکل با ظاهری مشخصاند (شکل 1ـ 1).
سلولهاي مستقل از Substrate يا سلولهای حاصل از هضم تريپسين، حالت کروی دارند. مانند HL-60 (شکل 1ـ 1).
شکل 1ـ 1ـ انواع سلولها.
طراحی آزمايشگاه کشت سلولی
اتاق کشت بايد فضايی کوچک با حداقل رفتوآمد باشد و از وسايل و تجهيزاتی که بهراحتی ضدعفونی شوند مانند کابينت و ميزهای استيل استفاده شود. چيدمان و طراحی مناسب نحوه قرارگيری تجهيزات و وسايل مورد نياز نقش مهمی در کاهش آلودگی و کيفيت محصول دارد.
کابینت اتاق کشت باید از جنس استیل باشد و در یک گوشه آن و دور از روشویی قرار بگیرد. تجهيزات این اتاق سانتريفوژ، انکوباتور، بافرها و ظروف شيشهای است (شکل 1ـ2). اين چيدمان برای جایی است که هود لامينار در دسترس نباشد. استفاده از هود لامينار بهراحتی گراديان استريليتی را در آزمايشگاه کشت سلولی ایجاد میکند. جريان آرام افقی هود، این گراديان را آسانتر حفظ میکند (اگرچه استفاده از جریان آرام افقی در حال حاضر از نظر مقررات ایمنی محدودیت دارد).
يک آزمايشگاه بزرگ کشت سلول معمولاً از دو قسمت مجزا شامل يک منطقه يا اتاقک کوچک ايزولهای که داخل آزمايشگاه تعبيه شده است و يک قسمت آمادهسازی يا پرپ (Prep) تشکيل میشود. وجود منطقة ايزوله از آلودگیهای ناشی از رفت و آمد کارکنان آزمايشگاه میکاهد. مواد و سلول تازه به فضای آزمايشگاه وارد و پس از بررسی از نظر آلودگی برای کشت به قسمت ايزوله منتقل میشود. ترجيحاً برای جلوگيری از باز شدن بیمورد در اتاقک ايزوله، در و ديوارهای آن از شيشه ساخته میشوند. اتاقک ايزوله خود به تجهيزاتی همچون انکوباتور، فريزر، يخچال، سانتريفوژ و نيز هودی که قابليت به دام انداختن و خروج پاتوژن را داشته باشد، نياز دارد (شکل 1-3).
هود لامينار
با اختراع جريان لامينار يا هود با دميدن هوای استريل روی سطح کار، کنترل بيشتر استريليتی را با هزينه کمتر از آمادهسازی يک اتاق استريل فراهم میکند. هود به صورت کابينتهای مجزايی است که در گوشه ای از آزمايشگاه با کمترين رفتوآمد قرار میگیرد و هر آزمايشگر میتواند جداگانه کار خود را پيشبرد. همة مراحل کشت سلول مانند پاساژ دادن، تهيه و تعويض محيط کشت و غيره که بايد در شرايط استريل صورت گيرد در زير هود انجام میشود. هنگام کار، آزمايشگر مجاز است فقط تا حد بازوهای خود را درون هود قرار دهد. در بیشتر هودهای لامينار جريان هوای استريل به طور عمودی وارد سطح کار هود میشود (شکل 1ـ4). اين هود مجهز به فيلتر هپا است که همه ذرات معلق در هوا را میگيرد. در کنار اين فیلتر، لامپ ماورای بنفش نيز درون هود تعبيه شده است که به استريلسازی فضای کار هود کمک میکند. البته ميزان توانايی هود در استريلسازی هوای خارج شده از آن که با فيلتر هپا قابل تنظيم است، به کلاس هود بستگی دارد. در حال حاضر انواع هود موجود در بازار به سه کلاس I،II و III تقسیم میشود. در بسياری از موارد استفاده از يک هود کلاس II برای کشت سلولی مناسب است. به منظور جريان هوای مطلوب باید تعداد وسايل داخل هود تاحد امکان کم و منحصر به لوازم ضروری باشد (شکل1ـ 5). حدود 15ـ10 دقيقه پیش از شروع کار، هود را روشن میکنیم تا هوای درون هود استريل و آماده کار شود.
تصوير سمت راست (b) برش عمودی يک کابين هود لامينار کلاس II را نشان می دهد. به ورود هوا در کاپوت جلو و گردش آن (فلشهای کناری کابين)، خروج هوا (تقريبا 20%، فلش بزرگ بالايی) به اتاق يا فيلتر شدن آن و ورود دوباره هوای استريل از طريق فيلتر هپا (تقريبا 80%، فلشهای سمت منطقه کار) توجه کنيد.
حدود عملکرد سلول (Hela) | سطح بر حسب سانتی متر مکعب | حجم محيط برحسب ميلیليتر | تعداد کپی | ظروف کشت | |
106×1 | 0.3 | 0.2- 0.1 | 96.144 | ميکروتيتراسيون | پليتهای چندچاهکی |
106×5 | 2 | 2.0-1.0 | 4 | 4 چاهکی | |
106×2 | 10 | 3.0-1.0 | 6 | 6 چاهکی | |
106×5 | 2 | 2.0- 1.0 | 24 | 24 چاهکی | |
106×2 | 8.0 | 3.0-1.0 | 1 | قطر 35ميليمتری | پتری ديشها |
106×4 | 17.5 | 4.0 | 1 | 50 ميليمتری | |
106×5 | 21 | 5.0 | 1 | 60 ميليمتری | |
107×1 | 49 | 10.0 | 1 | 90 ميليمتری | |
106×5 | 25 | 5.0 | 1 | 25 سانتيمتر مکعب | فلاسکها |
107×2 | 75 | 30-15 | 1 | 75 سانتيمتر مکعب | |
107×7 | 175 | 100-50 | 1 | cm2 175 | |
106×3 | 850 | 250-100 | 1 | بتری غلطان | |
1010×1 . 107×1 | 250-10 | 1 | 250-10 | بتریهای همزن دار |