نكته: هنگام رنگ آميزي سلول با تريپان بلو مدت زمان مهم است، چون با گذشت زمان سلول­هاي زنده هم رنگ مي‌گيرند و باعث بروز خطا در شمارش سلول مي‌شوند. حداكثر مدت زمان رنگ آميزي با تريپان بلو 3 دقيقه است.

• Tetrazolium assay:نام دیگر اين روش رنگ­آميزی MTT است. سلول زنده مي‌تواند متابوليسم اكسيداتيو انجام دهد. بنابراين ميتوكندري سالم دارد و مي‌تواند اکسیژن مصرف كرده و با اكسيداسيون رنگ MTT را بشكند و رنگي در محدودة زرد تا آبي توليد ‌كند. با آزمايش رنگ­سنجي (Colorimetric assay) تعداد سلول­های زنده مشخص مي‌شود.

مراحل آزمايشMTT: (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)

مراحل آزمايش از ابتداي كشت سلولي تا بررسی نتايج با فتومتر در يك ميكروپليت انجام مي­شود بنابراین تكرارپذيري، دقت و حساسيت آزمايش بالاست.

1- اگر آزمايش روي سلول­هاي چسبيده به پليت انجام می­شود،  ابتدا بايد تعدادمناسبی سلول (حدود 20000 سلول) را در هر يک از چاهک­ها کشت داده و اجازه داد که سلول­ها به کف پليت بچسبند و ثابت شوند.

2-  چاهك­هاي کنترل و آزمايش را انتخاب و مقدار مناسبی از ماده ميتوژن يا داروی مورد نظر را به چاهک­های آزمايش اضافه کنيد و پليت را تا زمان مورد نياز در انکوباتور قرار دهيد تا مادة مورد نظر روی سلول­ها اثر کند.

3-  پس از پایان زمان انکوباسيون محيط کشت رويی را دور بریزید و به هر چاهک 200 ميکروليتر      محيط حاوی نيم ميلی­گرم در ميلی­ليتر محلول MTT اضافه کنید و دوباره

به مدت 2 تا 4 ساعت در انکوباتور دی اکسيدکربن در 37 درجة سانتی­گراد قرار دهيد.

، 4- در طی انکوباسيون MTT با آنزیم سوکسينات دهيدروژناز که يکی از آنزيم­های چرخة تنفسی ميتوکندري­هاست، احيا می­شود. احيا و شکستگی اين حلقه منجر به

توليد کريستال­های آبی فورمازان می­شود که در زير ميکروسکوپ به­راحتی تشخيص داده

می­شوند. ميزان رنگ توليد­­شده با تعداد سلول­هايی که از نظر متابوليک فعال­اند (سلول­های زنده) رابطه مستقيم دارد.كريستال­هاي فورمازان در آب نامحلول بوده و قبل از رنگ سنجي باید با  مادة حلالي نظير دي متيل سولفوكسايد محلول شود.

5-  در نهايت جذب نوری محلول به دست­آمده را می­توان در طول موج 570 نانومتر خواند و به کمک منحنی استاندارد تعداد سلول ها را محاسبه نمود. ارتباط خطی بين  تعداد سلول­ها و جذب نوری محلول نهايی برای هر تيرة سلولی مخصوص آن تیره است.بنابراین، برای بررسی هر نوع سلول بايد منحنی استاندارد همان تيرة سلولی را رسم نموده و استفاده کرد.

6- در مورد سلول­های معلق بايد پس از پایان مراحل کار کشت سلولی پليت را در دور g 400 سانتريفيوژ کرد تا سلول­های معلق در کف پليت رسوب کنند. در صورت لزوم می­توان سلول­ها را با الکل يا فرمالدئيد در کف پليت ثابت نمود. برای حفظ خصوصیات آنزیمی عمل تثبیت باید در زمان کوتاهی انجام شود. سپس سلول­ها را با بافر فسفات سرد شستشو دهید و بر روی آن ها محيط كشت حاوی MTT بيفزاييد. بقية مراحل شبيه سلول­های  چسبيده است.

7- براي تهيه منحني استاندارد، ابتدا يك سوسپانسيون سلولي با غلظت كاملاً مشخص، (يک ميليون سلول در ميلي ليتر) از سلول­های مورد نظر تهيه کرده و پس از بررسی درصد سلول­های زنده تعداد مشخصی از آن را به صورت تکرارهای چهارتایی (quadruplicate) در پليت 96 چاهکی کشت سلولی کشت دهيد.

8- پليت را به انكوباتور دي­اكسيد­كربن منتقل و چند ساعت انكوبه كنيد تا سلول­ها به پليت بچسبند ( در مورد سلول­های شناور به انكوباسيون نيازی نيست). سپس، براي چاهك­های فوق تست   MTT انجام دهید  و با به­دست آوردن مقادير جذب نوري در مقابل تعداد سلول منحني استاندارد مربوطه را رسم كنيد.

3- شمارش تعداد كلوني‌ها  Colony – forming assay

اين روش عموميت ندارد و بيشتر براي سلول­هايي كه تشكيل كلوني مي‌دهند استفاده مي‌شود. درواقع قدرت كلوني­زايي سلول (يعني سلول بتواند يك كلوني اطراف خود ايجاد كند) را مي‌سنجد.وقتي مي‌گويند سلول 90% قدرت كلون زايي دارد، يعني 90% سلول زنده است و توانايی تولید کلونی را دارد.

4– تعیین LDH( LDH determination):وقتي سلول قدرت بقای خود را از دست مي‌دهد، آنزيم­هايي را آزاد می­کند كه در زمان حياتش در خود نگه می­دارد. با اندازه­گيري اين آنزيم­ها، كه معروف­ترين آن­ها لاكتات دهيدروژناز (LDH) است‌، مي‌توان نسبت سلول­هاي مرده  به زنده را حساب كرد.

5- اندازه­گیری انرژی درون­سلولی(Intracellular energy charge): با اندازه­گيري انرژي درون سلول­ها، بقای آن­ها را مي‌توان تخمين زد. سلولي كه بتواند ATP  توليد كند زنده است. با مقايسة این مقدار ATP با يک مقدار استاندارد می­توان قدرت بقای کشت سلول را تخمين زد.

مرگ سلولي  (Cell Death)

دو نوع مرگ سلولی وجود دارد:

• مرگ سلول در اثر نكروز: طي يك فرآیند پاتولوژيك غشای سلولي صدمه ديده و از بين مي‌رود.
• مرگ سلول در اثر آپوپتوز: این مرگ كه نوعی خودكشي برنامه­ريزي­شده سلول است، از راه تعدادی از مسيرهای پیام رسانی درون سلولی روی می دهد.مشخصة اصلي آپوپتوز تشکيل لاشه­های آپوپتوزی(apoptotic bodies ) است.