2- روش ميكروسكوپي فلورسانس(Fluorescent microscopy ):
غشای سلول سالم اجازة ورود بعضي از رنگها (پروپيديوم آيدايد یا PI) را به سلول نمي‌دهد، اما رنگهايي مثل آكريدين نارنجیAcridine Orange) ) مي‌توانند از داخل غشا رد شده و به هسته وارد شوند. اين رنگها در DNA نفوذ میکنند و بين بازهای DNAقرار میگيرند(Stacking) و نور فلورسانس را منعکس میکنند.
آپوپتوز دو مرحله دارد. در مراحل اوليه هنوز غشا خاصيت نفوذپذيري انتخابيش را دارد و اجازة ورود PIرا به سلول نمیدهد، در حاليکه آكريدين نارنجی وارد هسته شده و می تواند جریان شروع تكهتكهشدن DNA سلول در حال آپوپتوز را نشان دهد. در مراحل انتهايی آپوپتوز، غشا خاصيت نفوذپذيري خود را از دست مي‌دهد. در نتيجه،سلول به يك سلول نكروتيك تبديل میشود(اين سلول غشا دارد، اما خاصيت نفوذپذيري انتخابی ندارد) و بهراحتي با PI رنگ مي‌شود(شکل 2-8).
آکريدين نارنجی و پروپيديوم آيدايد. سلولهای قرمز ، به رنگ PI نفوذپذيرند.این نفوذپذیری نشاندهندة مراحل انتهايی آپوپتوز است. سلولهای نارنجی، به رنگ آکريدين نارنجی نفوذپذيرند که این نفوذپذیری نشان دهندة سلولهای زنده يا مراحل ابتدايی آپوپتوز است.
3- روش Sub-G1 peak:
هنگام آپوپتوز اندونوكلئاز اثر میکند و DNA را مي‌شكند.تکه هایDNA از غشا بيرون میآیند. بنابراين، ميزان DNA كم مي‌شود.با روش فلوسيتومتري ميتوان تعداد سلولهايي را كه DNA كمتري دارند مشخص كرد. فلوسيتومتري تعداد و شدت وقايع فلورسانس را اندازهگيري مي‌كند و به صورت كلي نشان مي‌دهد.
سيكل سلولي شامل ميتوز و اینترفاز(G1 ، S ، G2) است.اگر در منحني كه فلوسيتومتري نشان میدهد، پيك(Peak) تشكيلشده در فاز G1تغيير یافته باشد، نشاندهندة نقص DNA در داخل سلول ودر نتیجه آپوپتوز است.
4- استفاده از آنکسين (Annexin V-FITC) F ITC-V
آنکسين– پنج در واقع ليگاند فسفاتيديل سرين است، كه بهطور طبيعي در سمت سيتوپلاسمي لاية غشا قرار دارد. در آپوپتوز غشای ميتوكندري در مراحل اوليه تخريب میشود. بدين صورت كه شارژ غشا از بين رفته و نفوذپذيري خود را از دست مي‌دهد. در نتيجه، باعث آزادسازی سيتوكروم C مي‌شود كه خاصيت فليپازي فسفوليپيدها دارد يعني مي‌تواند فسفوليپيدها را در عرض غشا جابجا كند. بنابراين، فسفاتيديل سرين از لايه سيتوپلاسمی غشا وارد لايه خارجی میشود.
در اين روش از آنكسين- پنج كونژوگه با رنگ فلورسانس FITC استفاده میشود(Annexin V- FITC). در صورت القای آپوپتوز، بعد از 72 ساعت ميزان سلولهاي آپوپتوز شده زياد میشود. درنتیجه، Annexin V- FITC به سلولهای آپوپتوتيک متصل شده و به رنگ سبز در میآيد. این سلول ها با فلوسيتومتری و ميکروسکوپ فلورسانس تشخيصپذیر است. براي شناسايي مراحل آپوپتوز و تفكيك نكروز از آپوپتوز همزمان از رنگ PI استفاده مي‌شود. همانطوركه قبلاً اشاره شد، رنگ PI در صورت از بين رفتن غشای سلول، وارد سلول شده و به رنگ قرمز در فلوسيتومتري و با ميکروسکوپ فلورسانس قابل رديابی است.
اگر در نمودار فلوسايتومتری سلولها به FITC پاسخ مثبت دهند ولي به رنگ PI پاسخی ندهند، سلول در مراحل اولية آپوپتوز است. اگر با PI رنگ شوند و با FITC رنگ نشوند سلول دچار نكروز شده است. اگر با هر دو رنگ FITC و PI رنگ شوند سلولها در مراحل آخر آپوپتوز هستند. چون سلول در هر دو حالت نکروز و مراحل آخر آپوپتوز خاصيت نفوذپذيری انتخابی خود را از دست دادهاست با کمک اين روش نمیتوان اين دو پدیده را از هم تفکیک کرد.
۵- روش TUNEL:
اين روش بيشتر در جنين شناسي استفاده میشود. هنگام آپوپتوز DNAی قطعه قطعه و درنتیجه انتهاهاي 3´-OH زيادي تولید میشود. در اين روش تشخيصي از نوكلئوتيدهايي كه با بيوتين كونژوگه شده-اند، استفاده مي‌شود. بيوتين يا Digoxigenin به محيط کشت اضافه میشود و DNA پليمراز که در اينجا TdT است، آنها را به جاي تيميدين در داخل DNAقرار میدهد. بنابراين، بيوتين يا Digoxigenin با آنزيم TdT (تري داكسي نوكلئوتيديل ترمينال ترانسفراز) كه بدون استفاده از الگو نوكلئوتيدهاي محيط را به انتهای 3´-OH آزاد اضافه میکند، به DNA وارد میشود. بنابراين، با توجه به وفور انتهاهاي 3´-OH آزاد در سلولهای آپوپتوتيک، سلولهای آپوپتوز شده به طور زياد با بيوتين يا Digoxigenin نشاندار شده و با استفاده از آنتی بادیهای ثانوية نشاندار زير ميكروسكوپ فلورسانس شناسايی میشوند.
۶- استفاده از رودامين 123 و PI exclusion(پروپیدیوم آیداید) :
اولين رویداد در آپوپتوز از بين رفتن شارژ غشا ميتوكندري است. یعنی خاصيت انتقالي و نفوذپذيري اختصاصي غشای ميتوکندری از بين میرود و سوراخهاي بسیار بزرگی در غشا تولید میشود كه مولكولهاي بزرگ مي‌توانند از آن عبور کنند.
در حالت طبيعي رودامين 123 وارد ميتوكندري میشود و به دليل وجود غشای فعال و باردار نمیتواند از آن خارج شود و سلول با این ماده رنگ میشود. در سلولهاي نكروز و يا مراحل انتهايي آپوپتوز apoptosis) (Late ميتوکندری قادر به نگهداری رودامين 123 نيست و از طرفی با PI رنگ میشود.
در مراحل اولية آپوپتوز سلولها به مقدار کم با رودامين 123 رنگ میشوند، ولی با PI رنگ نمیگیرند. هرچه آپوپتوز پيش برود،میزان پاسخگویی سلولها به رودامین کم و به PI زیاد میشود.
7- بررسي فعاليت كاسپاز 3 (سيتئين آسپارتات سرين پروتئاز 3):
در اين روش از آنتی بادی پروتئين کاسپاز 3 استفاده مي‌شود.كاسپاز آبشاري از پروتئازها را در سلول فعال مي‌كند. كاسپاز 8 شروعكنندة فرايند پروتئازي و كاسپاز 3 ، آخرين كاسپاز از نظر فعالکنندگی و كاسپاز عملكردي (فانكشنال) است.
در اين روش با استفاده از آنتيكاسپاز 3 (كاسپاز فانكشنال) سلولهاي آپوپتوز را نشاندار کرده و سپس فلوسيتومتري انجام میشود و تعداد سلولهاي نشاندار شمرده میشوند. اگر سلولها طبيعی باشند92% آنها با آنتی بادی نشاندار نشده و سالماند. (كاسپاز 3 در سلولهاي طبيعي وجود دارد، اما فانكشنال نيست و با آنتیبادی شناسايی نمیگردد. اين کاسپاز غيرفعال با كاسپازهاي 7 و 6 فعال میشود.)
