محیط کشت

جدول محتوا

محيط کشت

محيط‌های کشت بافرهای متفاوتی براي حفظ و نگهداری pH دارند. معروف‌ترين بافرها بی‌کربنات و PBS است.

اگر co₂ محيط انکوباتور کم باشد، اسيد کربنيک محيط کشت تجزيه شده و co₂ آزاد می‌شود که این واکنش محيط را قليايی می‌کند و فنلرد به رنگ ارغوانی پررنگتر از محيط معمولی درمی‌آيد. اگر محيط کشت اسيدی شود، فنلرد محيط کشت به رنگ زرد در می‌آيد.

اگر محيط کشت به رنگ زرد کدر درآید، نشانه آلودگی محیط با باکتری است.

يک محيط استاندارد در (Optimize) PH=7/4 قرمز يا ارغواني روشن است. در محيط اسيدی زرد رنگ و هرچه pH افزايش می‌يابد ارغوانی می‌شود.

توجه: در صورت وجود چند فلاسک از يک محيط کشت، بهتر است همه آنها از نظر تغيير pH کنترل شوند تا در صورت آلودگی از بقيه جدا شوند.

جدول 1ـ4ـ تغيير رنگ محيط کشت حاوی فنلرد در pH مختلف:

pH	رنگ محيط کشت
7/7	ارغوانی
6/7	قرمز متمايل به آبی
4/7	قرمز
7	نارنجی
5/6	زرد

چهار نوع عمده کشت سلول

1-کشت عضو : (organ culture) بافت از یک طرف در محيط کشت غوطه‌ور است و از طرفی به طور مستقيم تبادل گاز انجام می‌دهد. اين وضعيت باعث حفظ خصوصيات بافتی عضو مورد نظر می‌شود (شکل 1-6). اين روش به دليل مشکلاتی نظير عدم اکسيژن‌رسانی و تغذيه مناسب سلول‌های درون بافت استفاده چندانی ندارد. و تنها جهت نگهداری بافت در مدت زمان کوتاه استفاده می‌شود. برای رفع اين مشکل، بافت را میتوان در سيستم‌هايی (بيوراکتورهايی) مثل بطری غلطان يا اسپيندار کشت داد.

2-کشت سلول اوليه (Primary calture or explants culture) : در اين حالت سلول‌های جدا شده از بافتهای بدن جنين يا جاندار زنده، در ظرف کشت، کشت داده می‌شود به صورتي‌که کاملا در محيط کشت قرار گيرند. اين نوع کشت به نام کشت اوليه انجام می‌گيرد (شکل 1ـ6).

3-کشت سلول جدا شده (Dissociated all culture): در اين روش کشت، سلول‌هاي جداشده به صورت تکه‌لايه روی سطح جامد رشد مي‌نمايند (شکل 1ـ6). اين نوع کشت بيشتر در آزمايشگاه‌های تحقيقاتی انجام می‌شود و نوع معمول کشت سلول است.

4- Organotypic culture: هم‌کشتی دو يا چند نوع سلول در کنار يکديگر را گويند (شکل 1ـ6).

منابع بافتی برای کشت سلولی

برای کشت سلول می‌توان از هر دو نوع سلول‌های بافت‌های جنينی و بالغین استفاده کرد. بافت‌های جنينی به علت عدم تمايز کامل و وجود سلول‌های بنيادی عمر بيشتری داشته و بهتر رشد می‌کنند، در حاليکه سلول‌های بالغین قدرت تکثير و عمر کوتاه‌تری دارند.

نمونه‌هايی از تيره‌های سلولی جنينی، که کاربرد زيادی دارند 3t3 (فيبروبلاست‌های جنينی موش)، MRC-5 (فیبروبلاست ریه انسان) و فيبروبلاست‌های ريه جنين انسان می‌باشند.

کشت سلول‌های بالغين از نظر منشأ جنينی با هم متفاوت است. سلول‌های مشتق از بافت‌های مزودرمی (فيبروبلاست‌ها، اندوتليوم و ميوبلاست‌ها) بهتر و راحت‌تر از سلول‌های مشتق از بافت‌های اندودرمی (سلول‌های اپيتليال) و اکتودرمی (نورونها) کشت می‌شوند و به فاکتورهای ميتوژنيک سرم بهتر پاسخ می‌دهند. تجربه نشان می‌دهد فاکتورهای سرم موجب مهار رشد و تمايز سلول‌های اپيتليال می‌شود.

جدول 1ـ 5 ـ نمونه‌هايی از مهمترين تيره‌های سلولی چسبنده.

نام تيره سلولی	بافت منشأ	مورفولوژی
MRC-5	ريه انسان	فيبروبلاست
Hela	گردن رحم انسان	اپیتليال
VERO	کليه ميمون سبز آفريقايی	اپیتليال
NIH3T3	جنين موش	فيبروبلاست
L929	بافت همبند موش	فيبروبلاست
CHO	تخمدان همستر چينی	فيبروبلاست
BHK-21	کليه همستر سوريه‌ای	فيبروبلاست
HEK293	کليه انسان	اپیتليال
HEPG2	کبد انسان	اپیتليال
BAE-1	آئورت گاو	اندوتليال

جدول 1ـ6 ـ نمونه‌هايی از مهمترين تيره‌های سلولی شناور.

نام تيره سلولی	بافت منشأ	مورفولوژی
NSO	ميلوم موش	شبه لنفوبلاستوئيد
U937	لنفوم هيستيوسيت انسان	لنفوبلاستوئيد
Namalwa	لنفوم انسان	لنفوبلاستوئيد
HL60	لوسمی انسان	شبه لنفوبلاستوئيد
WEHI231	لنفوم سلول‌هایB موش	لنفوبلاستوئيد
YAC1	لنفوم موش	لنفوبلاستوئيد
U266B1	ميلوم انسان	لنفوبلاستوئيد
SH-SY5Y	نوروبلاستوم انسان	نوروبلاست

سینتيک رشد سلول

در استانداردسازی مطالعات کشت سلولی شناسايی خصوصيت رشد تيره سلولی مورد مطالعه و تهيه منحنی رشد آن لازم است. این عوامل اطلاعات مفيدی درمورد فواصل پاساژ سلولی و تعداد سلول‌ها در هر پاساژ را در اختيار ما قرار می‌دهد.

منحنی رشد چيست؟

نامگذاري اين منحني به منحني رشد به اين دليل است كه بعد از گذشت معمولا 48 ـ 24 ساعت از كشت سلول در ظرف (زمان دوبرابرشدن)، سلول‌ها تكثير می‌یابند.

ابتدای منحنی فاز Lag (فاز تأخير) است كه در آن هنوز تعداد سلول‌ها زياد نشده است. در این فاز تعداد سلول‌های تکثيريافته با تعداد سلول‌های مرده برابر است. با گذشت زمان سلول‌ها تكثير می‌یابند.این فاز را Log می‌نامند. سپس سلول‌ها وارد فاز سکون می‌شوند. اين رخداد هنگامی است که ظرف كشت پر شده (Contact inhibition) و سلول‌ها جايی برای تكثير ندارند. همچنين ميزان مواد غذايی به حداقل رسيده است. البته این وضعیت در مورد سلول‌های سرطانی صدق نمی‌كند، چون سلول‌های سرطانی می‌توانند بر روي یکديگر تكثير يابند، درواقع اين سلول‌ها Contact inhibition ندارند. بعد از فاز سکون، به‌دليل تجمع مواد متابوليتی و کاهش مواد مغذی محيط، سلول‌ها از بين می‌روند.این فاز را فاز نزولي يا Decline گويند.

فوايد منحنی رشد

1- تعيين زمان اضافه كردن محيط كشت و پاساژ دادن (Subculture)

نكته: Subculture همان پاساژ دادن سلول است. در مورد سلول‌های چسبنده آنها را از كف ظرف کشت جدا كرده، به‌صورت سوسپانسيون سلولی به يك يا چند ظرف ديگر منتقل مي‌كنند.

2- تعيين کیفیت سرم، محيط يا فاكتور رشد اضافه شده به محيط كشت سلول با کمک منحني رشد.

سؤال: آيا مي‌توان در زمان دلخواه (هر 4 ساعت يكبار) به سلول‌ها سرم و مواد مغذی اضافه كرد؟

چون سلول در محيط كشت شرايط و محيط جديد جدا از بدن را تجربه می‌كند، برای شناسايی خود و محيط اطرافش به زمان نیاز دارد. از اين رو، به سلول در محيط كشت به مدت 5-4 روز چيزی اضافه نمی‌شود تا خود سلول برای سازگاری با محيط اطرافش شروع به توليد مواد محرك تكثير كند. البته اين زمان به نوع سلول بستگی دارد. بعد از اين مدت زمان، همه یا بخشی از محيط قبلي خارج و محيط جديد به آن اضافه مي‌شود.

از موارد شایان توجه هنگام کشت سلول، درنظرگرفتن تاریخ انقضای (Lot number) سرم و محيط كشت است. درصورتیکه این تاریخ گذشته باشد، سلول‌ها به‌خوبی رشد نمی‌کنند و حتی در صورت رشد، تغییر ماهیت می‌دهند.

در 5 ـ4 روز اول ميزان محيط اضافه‌شده به كشت به ظرف كشت بستگی دارد. مثلاً به فلاسك محيط اضافه می‌شود. و به‌طورمثال 10-8 میلی‌لیتر به فلاسک T₂₅ و 20 میلی‌لیتر به فلاسک T₇₅محیط اضافه می‌شود.

برای بقای سلول‌ها در کشت اولیه سلول، انتخاب ظرف و تعداد سلول کشت‌یافته بسیار مهم است. تحقیقات نشان داده است که سلول‌ها برای بقا به برهم‌کنش با یکدیگر ازطریق پیام‌رسانی (انتقال سیگنال) نیاز دارند و دور بودن آنها از یکدیگر میتواند باعث آپوپتوز شود. البته این موضوع در همه سلول‌ها صدق نمی‌کند.

زمان پاساژ دادن: بسته به نوع سلول 5-4 روز تا يك هفته بعد از Feeding و پیش از رسیدن به فاز ثابت Saturation، باید پاساژ را شروع كرد (زماني كه سلول ها 80%- 75% ظرف كشت را اشغال كرده‌اند.)

برای تشخيص اينکه سلول هنگام کشت به سلول سرطانی تغيير يافته يا خصوصيت خود را حفظ کرده است، آگاهی از زمان رسيدن به فاز سکون Saturation Density مهم است.

در منحنی رشد زمان دو برابر شدن سلول (PDT) محاسبه می‌شود و سلول ترانسفورم‌شده cell) (Transformed در مقایسه با سلول نرمال در زمان طولانی‌تری به فاز ثابت (Saturation density) می‌رسد.

مثلاً اگر زمان دو برابر شدن معمول يك نوع سلول 16 ساعت باشد و در حين کشت به 24 ساعت برسد، ممکن است آن سلول مورد نظر نباشد يا اينكه فاکتوری از محيط كشت كم شده و محیط کشت آلوده شده است. (آلودگي مايكوپلاسمايي كه در ظرف كشت چيزی نشان نمی‌دهد اما زمان دو برابر شدن سلول را افزايش می‌دهد).

اصطلاحات منحنی رشد

Lang lag : طولانی شدن فاز تأخير، يعنی هنوز سلول‌ها براي تطابق با محيط کشت و سرم به زمان نیاز دارند.

Short doubling time : كوتاه شدن فاز تكثير، يعني سلول‌ها سريع رشد می‌كنند. (در زمان كوتاه تعداد بيشتری سلول توليد می‌شود.)

منحنی رشد در عمل (Protocol)

Step1 : سلول‌های چسبنده كشت داده در فلاسك T₇₅ با تريپسين يا Cell Scraper جدا می‌شوند. سپس، در لوله فالكون ريخته و سانتريفوژ می‌شوند. سپس 50 هزار سلول در ميليليتر را در هر خانه از پليت‌های 24 خانه منتقل می‌کنند.

مطابق شکل 1-9 در لوله فالكون كه 1.6 ميليون سلول در ميلی‌ليتر است، برای انتقال 50 هزار سلول در هر خانه از پليت 24 خانه چنين محاسبه می‌شود.

ml 26 × cell/mL 10⁴ × 5 = x× cell/mL10⁶× 6/1

حجم سلول به جای 24 خانه برای 26 خانه آماده می‌شود تا هنگام استفاده كم نيايد.

µL 800 یا mL 8/0 = X

مقدار سلول بدست‌آمده در mL 25.2 محيط اضافه می‌شود.

سپس سوسپانسيون سلولی با پيپتاژ يكنواخت و در هر خانه (چاهک) ريخته و در نهايت در انكوباتور قرار داده می‌شود. در هر رديف چاهک‌ها (هر پليت 24 خانه 6 رديف چهارتايی دارد.) بر اساس زمان تقسيم‌بندی می‌شوند بدين صورت كه سلول‌های رديف اول 24 ساعت، رديف دوم 48 ساعت، رديف سوم 72 ساعت، رديف چهارم 96 ساعت، رديف پنجم 120 ساعت و سرانجام رديف ششم 144 ساعت بعد شمارش می‌شوند. يعنی شمارش بايد در مدت 6 روز انجام شود.

هنگام شمارش سلول‌ها بعد از 24 ساعت اول محيط رويی رديف اول را برداشته و با PBS شسته می‌شود. چون محيط حاوي FBS است و هنگام جدا كردن سلول از كف پليت FBS تريپسين را غيرفعال می‌كند، بنابراين، با دو تا سه بار شستشو با PBS سرم خارج می‌شود. سپس، به هر خانه حدود 350 ميكروليتر تريپسين اضافه می‌شود. پس از گذشت سه دقيقه در انكوباتور، 650 ميكروليتر محيط حاوي 10% FBS برای خنثی کردن تریپسین به چاهک‌ها اضافه می‌شود. سپس، سلول‌های هر خانه جداگانه شمارش می‌شوند. اين روند به مدت 6 روز برای 6 رديف از 24 خانه صورت می‌گيرد. با ميانگين گرفتن 4 خانه در هر روز، منحنی رشد همان روز رسم می‌شود (شکل 1ـ10 رسم منحنی رشد با نرم‌افزار Excel را نشان می‌دهد).

نكته: اين مراحل براي سلول‌هايی كه سوسپانسيون هستند آسان‌تر است. در این سلول‌ها چون از تريپسين استفاده نمی‌شود، نياز به شستن با PBS نيست.