Sales: 021-88224007
0

نکات کليدی

سرفصل ها

[postlist]

نکات کليدی

1-  هنگام شمارش ابتدا تعداد كل سلول­ها را  بدست آورده (يعني هم سلول­هاي بي رنگ و هم آبي شمارش شوند) سپس تعداد سلول­هاي رنگ گرفته يا نگرفته محاسبه شوند.

2- هر يك از دو اتاقك شمارش از 5 خانه مربعي شكل بزرگ تشكيل شده­است. سطح هر يك از اين خانه­هاي مربعي شكل يك ميلي­متر مربع است.

3- مربع ­هاي كناري هركدام از 16 مربع كوچك­تر تشكيل شده­ و در آزمايشگاه­هاي تشخيص طبي به نام نواحي شمارش گلبول­هاي سفيد معروف هستند.

4- مربع مرکزی از 25 مربع کوچک­تر تشکيل شده و در آزمايشگاه­هاي تشخيص طبي به نام ناحيه شمارش گلبول­هاي قرمز معروف است.

توجه: ارتفاع اتاقک شمارش، یعنی فاصلة بين لام و لامل 1/. ميلی­متر است. بنابراين، حجم هر يک از اين مربع­های 16 خانه­ای 1/. ميلی­متر مکعب است.

حجم هر مربع16 خانه­ای  =۱/.×1×1 = 1/.mm۳ =4 –10× ۱ cm۳(mL)

معمولاً برای اطمينان از صحت شمارش، سلول­های موجود در تعداد بيشتری از مربع­ها شمارش شده و نتيجه به دست آمده به تعداد مربع­های شمارش شده تقسيم و عدد به دست آمده در 10000 ضرب می­شود.

توجه: عوامل زيادی می توانند باعث خطا در شمارش سلولی شوند که عبارتند از:

1- ورود حباب هوا به اتاقك شمارش سلول هنگام پر كردن آن.

2- وجود سلول­های قطعه قطعه شده در سوسپانسيون سلولی.

3- پر کردن بيش از حد اتاقک، به طوري­که سوسپانسيون سلولی وارد کانال­های کناری اتاقک شده يا وارد اتاقک مقابل شود.

4- تعلل در ريختن سوسپانسيون، به طوري­که سلول­ها به صورت يکنواخت پخش نشوند.در اين حالت، سلول­ها به علت سنگين­تر بودن رفته رفته در حين عبور روی لام رسوب می­کنند،بنابراین انتهای اتاقک، سلول کمتری خواهد داشت.

شمارش سلول بر روي لام نئوبار با ميكروسكوپ به صورت دستی انجام می­گيرد. اما روش راحت­تر وگران­تر استفاده از دستگاه شمارشگر سلول (Cell counter) است كه بيشتر در بانک­های سلولی، كه تعداد سلول­های زيادی می بايست شمارش شوند، مورد استفاده قرار می­گیرد. ‌  

شکل 2ـ2ـ شناسايی سلول های زنده بر روی لام نئوبار با استفاده از رنگ آميزی تريپان بلو.سلول های زنده (دايره های سفيد) و سلول های غير زنده (دايره های تيره).
شکل 2ـ2ـ شناسايی سلول های زنده بر روی لام نئوبار با استفاده از رنگ آميزی تريپان بلو.سلول های زنده (دايره های سفيد) و سلول های غير زنده (دايره های تيره).

2- شمارش هستة سلول با استفاده از هموسيتومتر: در اين روش سلول را بوسيله اسيد سيتريك ليز كرده، سپس با كريستال ويوله رنگ مي‌­کنند. هستة ارغواني را می توان زير ميكروسكوپ مشاهده کرده و شمارش نمود.

3- ميكروكريرها :(microcarrier) سطوحي با خلل و فرج زيادند كه سلول­ها داخل آن­ها رشد کرده و نمي‌توان به طور مستقیم سلول­ها را شمارش كرد. ميكروكريرها بيشتر در مورد کشت انبوه به وسيلة بيوراکتورها کاربرد دارند. برای شمارش سلول­ها توسط میکروکریرها  باید با استفاده از سرنگ، چندین بار آن­ها را پیپتاژ کرده تا سلول کاملا لیز و هسته ی آن آزاد شود. سپس، هسته­ها با استفاده از کریستال ویوله رنگ شده و شمارش می شوند.

4- پارتیکل کانتر Particle counter)): گاهی تعداد سلول­هایی که باید شمارش شوند خيلی زيادند. در چنين مواردي براي شمارش كل سلول­ها، از دستگاه­هاي شمارشگر سلولي(شکل 2-3) استفاده می شود. شمارش سلول با دستگاه پارتيکل کانتر آسان­تر است. این شمارش به دو صورت شمارش­گر Coulter و CASY انجام می­شود. مواقعی که سلول­ها تحت تاثير هورمون­ها، فاکتورهای رشد و يا عوامل سيتوتوکسيک( داروهای ضد سرطان) قرار می­گيرند از دستگاه­هاي شمارشگر سلولي کولتر ((Coulter استفاده می­شود. پارتيکل کانتر دارای لوله‌اي به قطر 70ميكرومتر است كه سلول از داخل لوله رد می­شود. دو الكترود يكي در خارج و يكي در داخل لوله قرار گرفته و جريان بين اين دو برقرار می­شود. با عبور سلول از داخل آن جريان بين اين دو لوله قطع و يك شماره ثبت مي‌شود. اين دستگاه کلاهک هايي(Cap)  دارد كه سوسپانسيون سلولي را در آن می ريزند. رنگ تريپان بلو در خود دستگاه وجود دارد. روش كار اين دستگاه چنين است كه مقداري از سلول همراه با كمي رنگ تريپان بلو مخلوط شده و درصد بقای سلول را همراه با منحني به آزمایشگر مي‌دهد.

یکی از مشکلاتی که هنگام کار با این دستگاه ممکن است با آن مواجه شویم گرفتگي مكرر لوله‌هاست که برای رفع آن می بايست سوسپانسيون سلولي يكدست و هموژن باشد.

شکل 2ـ3 ـ دستگاه شمارشگر سلولی
شکل 2ـ3 ـ دستگاه شمارشگر سلولی
در مورد تکه­ها يا خرده­های سلولی  (debris) بسيار زياد، از فيلتر يا مش استفاده مي‌شود. توجه: خطاي شمارش هنگام کار با هموسیتومتر20% است و با استفاده از Particle Counter خطاي شمارش سلول به 5% کاهش می يابد. 5- ردیابی توده سلولی(Biomass manitroing):این روش درشمارش سلول با بيوراكتور به کار می­رود که در آن از پروبی استفاده می­شود که امواج رادیویی تولید می­کند. مقدار امواج جذب شدة سلول را می توان محاسبه کرد. این مقدار با میزان تودة سلولی برابر  است. 6- استفاده از پروب فلورسانس: در اين روش، به­دنبال تحريك سلول با اشعة ماورای بنفش uv)) پروب فلورسنس با احياي NAD (نيكوتين آميد آدنوزين) در سلول نور تولید می­کند. به این ترتیب، تعداد سلول در محيط كشت با استفاده از نمودار استاندارد محاسبه می­شود. 7- آناليز تصوير (Image analysis): با استفاده از دوربين CCD (Charge-Coupled Device) از کشت سلول عکس گرفته می­شود و با انتقال داده­ها به نرم افزار مناسب بر روی کامپيوتر، اطلاعاتي از قبيل تعداد، اندازه و شكل هر سلول را می توان ارزيابی کرد. ب) روش هاي غير مستقيم شمارش سلولي: شناسايي تعداد سلول با استفاده از شواهد غير مستقيم به سه روش زير انجام می­گیرد:
  1. تعيين ميزان پروتئين سلول( Protein Determination)
  2. تعيين ميزان DNA  سلول (DNA Determination)
  3. تعيين ميزان گلوکز مصرفی (Glucose determination)
  • تعيين ميزان پروتئين سلول: پروتئین سلول مقياسی از زیست توده (کل مواد سلولی) محسوب می­شود. معمولاً محتوای پروتئين يک سلول پستاندارpg/cell 500 -100 است. این اندازه­گیری­ها همچنين در تعیین فعالیت آنزیم خاص مفید است،که معمولاً بیان­کننده حداکثر سرعت واکنش اندازه­گیری شدة يک آنزیم به کل پروتئین موجود در سلول است. رايج­ترين روش آزمايش رنگ­سنجی­ها روش­ لوری(Lowry) و برادفورد (Bradford) است. روش برادفورد به دلیل سرعت، حساسیت و دخالت ناچیز دیگر اجزای سلول بر روش لوری برتری دارد. در اين روش به سلول­های ليز­شده معرف کوماسی بلو اضافه می­شود و در عرض 10 دقيقه رنگ آبی­ ايجاد می­گردد. می­توان توسط يک رنگ­سنج يا اسپکتوفتومتر آن را اندازه­گيری و با پروتئين های استاندارد مقايسه کرد.
  • تعيين ميزان DNA سلول : مراحل اجرای این روش شامل ليزشدن سلول­ها در معرف فلورسانس است. معرف به DNAسلول باند می­شود. رديابی فلورسانس با معرف­هایی با حساسیت بالا مانند هوخست 33258 يا (DAPI) indole – 4,6- diamidino-2- phenyl صورت می گيرد.
  • تعيين ميزان گلوکز مصرفی سلول: رشد سلول را با تغيير در غلظت ترکيبات محيط کشت مي‌توان ردیابی کرد. یک روش سنجش غیر مستقیم تعداد سلول، اندازه­گیری تغيير در محتوای گلوكز محيط است. از دیگر ترکيبات محيط کشت که می­توان به اين منظور استفاده کرد، اندازه­گيری میزان توليد اسيد لاکتيک و يا ميزان مصرف اکسيژن است.
ارتباط بین تعداد سلول­ها و میزان مصرف یا تولید این ترکيبات نشان دهندة این است که اين  ارتباط برای یک نوع تيرة سلولی در شرایط یکسان، ثابت است،حتی اگر تيرة سلولی يا هر يک از شرايط کشت تغيير کند، ارتباط بين مصرف سوبسترا يا تشکيل محصول و تعداد سلول نيز تغيير خواهد کرد. ميزان گلوكز مصرفي سلول با سه آزمايش ارزيابی می­شود:
  • سنجش گلوکز اکسيداز:ميزان گلوکز سلول با يک آزمايش رنگ سنجی و با کمک دو آنزيم گلوکز اکسيداز و پراکسيداز اندازه­گیری می­شود.
D-glucose+H2O+O2 ↔ D-gluconic acid+ H2O2        (1) H2O2+reduced o-dianisidine ↔  2H2O+oxidized o-dianisidine (brown)    (2) Oxidized o- dianisidine+ H2SO4 ↔ oxidized o- dianisidine(pink) (3) معادلة 1 با گلوکز اکسيداز  (GOD)و معادلة 2 با پراکسيداز(POD) کاتاليز می­شود. سپس، محصول حاوی رنگ o-dianisidine hydrochloride  با کمک پراکسيد هيدروژن به محصولی – که در حضور اسيد سولفوريک صورتی می­شود –  احيا می­شود(معادلة 3) سرانجام، گلوکزاکسیداز با روش رنگ سنجی اندازه گيری می­گردد. 2- سنجش هگزوکيناز:ميزان گلوکز سلول به روش آنزيمی در دو واکنش کاتاليزشدة زير توسط هگزوکيناز(HK) و گلوکز 6-فسفات دهيدروژناز(G6PDH) اندازه­گيری می­شود. D-glucose+ATP ↔ glucose-6-P +ADP        (1) glucose-6-P +NAD ↔ 6-phosphogluconate + NADH+H+    (2) هگزوکيناز گلوکز را در حضور ATP  به گلوکز 6-فسفات تبديل می­کند (معادلة 1). بلافاصله گلوکز 6-فسفات توسط G6PDH به 6- فسفوگلوکونات تبديل می­شود (معادلة 2). ارتباط تشکيل   NADHبا تغيير در جذب در طول موج 340 نانومتر ردیابی می­شود. این نتیجه با غلظت گلوکز اصلی متناسب است. 3 -آناليز کننده گلوکز:در این روش سنجش گلوکز اکسيداز در يک دستگاه آناليز کننده صنعتی مانند آناليز کننده ی صنعتی YSI مدل 27 (Yellow Spring Instrument Co) انجام می­شود. در اين دستگاه غشاهای تثبیت شدة حاوی آنزیم­هایی قرار داردکه در نهایت می­تواندمتابولیت­های گلوکز و اسیدلاکتیک را تولید کند.این متابولیت­ها از طریق تغییر جریان الکترون شناسایی می­شوند.مثلاً آنزیم­های تثبیت شده در غشا گلوکز را متابولیزه می­کنند و پراکسیدهیدروژن تولید می­کنند.با تجزیة پراکسیدهیدروژن (معادلة 1) الکترون تولید می­شود که با حسگر کلارک (الکترود کلارک) مشخص می­شود.سپس، الکترون باعث تجزیة کلرید­نقره (معادلة 2) می­شود و جریان الکتریکی تولید می­کند. این جریان با یک آمپرسنج اندازه­گیری می­­شود و به صورت پتانسیل الکتریکی نمایش داده می­شود.در اینجا جریان سیگنال با مقدار گلوکز مصرف­شدة سلول متناسب است.با مقایسة گلوکز مصرفی با منحنی استاندارد می­توان تخمین دقیقی از تعداد سلول داشت. H2O2 ↔ 2H++ O2 +2e        (1) AgCl+ e ↔ Ag+ Cl        (2) اهميت قدرت بقای (Viability) سلول: در صورت تشخيص زنده يا مرده بودن سلول مي‌توان تصميم به توقف يا ادامة كار گرفت. کاربرد قدرت بقای سلول (Cell Viability):
  • در مطالعة سلول­هاي سرطاني
  • براي تشخيص رد­کردن يا رد­نکردن بافت پيوندي به انسان يا موجود مورد مطالعه. هر چه تعداد سلول­های زنده در محل پيوند(graft)بیشتر باشد، نشاندهنده موفقیت عمل پیوند است.
  • محاسبة ميزان سميت مواد سمي (Toxified) در in vitro و تعيين دوز مناسب دارو.
  • محاسبة اثر تخريب­كنندگي توكسين‌ها در محيط
مقایسة درصد سلول­های مرده هنگام شمارش سلول و بعد از مرحلة انجماد نشان­دهندة این است که شرايط انجماد براي سلول مناسب بوده یا نبوده است.

این مطلب را پسندیدید؟

-

به اشتراک بگذارید

یک پاسخ بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.فیلد هایی که با علامت ستاره 8 مشخص شده اند، الزامی هستند

[wp-reviews]
X