نکات کليدی
1- هنگام شمارش ابتدا تعداد كل سلولها را بدست آورده (يعني هم سلولهاي بي رنگ و هم آبي شمارش شوند) سپس تعداد سلولهاي رنگ گرفته يا نگرفته محاسبه شوند.
2- هر يك از دو اتاقك شمارش از 5 خانه مربعي شكل بزرگ تشكيل شدهاست. سطح هر يك از اين خانههاي مربعي شكل يك ميليمتر مربع است.
3- مربع هاي كناري هركدام از 16 مربع كوچكتر تشكيل شده و در آزمايشگاههاي تشخيص طبي به نام نواحي شمارش گلبولهاي سفيد معروف هستند.
4- مربع مرکزی از 25 مربع کوچکتر تشکيل شده و در آزمايشگاههاي تشخيص طبي به نام ناحيه شمارش گلبولهاي قرمز معروف است.
توجه: ارتفاع اتاقک شمارش، یعنی فاصلة بين لام و لامل 1/. ميلیمتر است. بنابراين، حجم هر يک از اين مربعهای 16 خانهای 1/. ميلیمتر مکعب است.
حجم هر مربع16 خانهای =۱/.×1×1 = 1/.mm۳ =4 –10× ۱ cm۳(mL)
معمولاً برای اطمينان از صحت شمارش، سلولهای موجود در تعداد بيشتری از مربعها شمارش شده و نتيجه به دست آمده به تعداد مربعهای شمارش شده تقسيم و عدد به دست آمده در 10000 ضرب میشود.
توجه: عوامل زيادی می توانند باعث خطا در شمارش سلولی شوند که عبارتند از:
1- ورود حباب هوا به اتاقك شمارش سلول هنگام پر كردن آن.
2- وجود سلولهای قطعه قطعه شده در سوسپانسيون سلولی.
3- پر کردن بيش از حد اتاقک، به طوريکه سوسپانسيون سلولی وارد کانالهای کناری اتاقک شده يا وارد اتاقک مقابل شود.
4- تعلل در ريختن سوسپانسيون، به طوريکه سلولها به صورت يکنواخت پخش نشوند.در اين حالت، سلولها به علت سنگينتر بودن رفته رفته در حين عبور روی لام رسوب میکنند،بنابراین انتهای اتاقک، سلول کمتری خواهد داشت.
شمارش سلول بر روي لام نئوبار با ميكروسكوپ به صورت دستی انجام میگيرد. اما روش راحتتر وگرانتر استفاده از دستگاه شمارشگر سلول (Cell counter) است كه بيشتر در بانکهای سلولی، كه تعداد سلولهای زيادی می بايست شمارش شوند، مورد استفاده قرار میگیرد.
2- شمارش هستة سلول با استفاده از هموسيتومتر: در اين روش سلول را بوسيله اسيد سيتريك ليز كرده، سپس با كريستال ويوله رنگ ميکنند. هستة ارغواني را می توان زير ميكروسكوپ مشاهده کرده و شمارش نمود.
3- ميكروكريرها :(microcarrier) سطوحي با خلل و فرج زيادند كه سلولها داخل آنها رشد کرده و نميتوان به طور مستقیم سلولها را شمارش كرد. ميكروكريرها بيشتر در مورد کشت انبوه به وسيلة بيوراکتورها کاربرد دارند. برای شمارش سلولها توسط میکروکریرها باید با استفاده از سرنگ، چندین بار آنها را پیپتاژ کرده تا سلول کاملا لیز و هسته ی آن آزاد شود. سپس، هستهها با استفاده از کریستال ویوله رنگ شده و شمارش می شوند.
4- پارتیکل کانتر Particle counter)): گاهی تعداد سلولهایی که باید شمارش شوند خيلی زيادند. در چنين مواردي براي شمارش كل سلولها، از دستگاههاي شمارشگر سلولي(شکل 2-3) استفاده می شود. شمارش سلول با دستگاه پارتيکل کانتر آسانتر است. این شمارش به دو صورت شمارشگر Coulter و CASY انجام میشود. مواقعی که سلولها تحت تاثير هورمونها، فاکتورهای رشد و يا عوامل سيتوتوکسيک( داروهای ضد سرطان) قرار میگيرند از دستگاههاي شمارشگر سلولي کولتر ((Coulter استفاده میشود. پارتيکل کانتر دارای لولهاي به قطر 70ميكرومتر است كه سلول از داخل لوله رد میشود. دو الكترود يكي در خارج و يكي در داخل لوله قرار گرفته و جريان بين اين دو برقرار میشود. با عبور سلول از داخل آن جريان بين اين دو لوله قطع و يك شماره ثبت ميشود. اين دستگاه کلاهک هايي(Cap) دارد كه سوسپانسيون سلولي را در آن می ريزند. رنگ تريپان بلو در خود دستگاه وجود دارد. روش كار اين دستگاه چنين است كه مقداري از سلول همراه با كمي رنگ تريپان بلو مخلوط شده و درصد بقای سلول را همراه با منحني به آزمایشگر ميدهد.
یکی از مشکلاتی که هنگام کار با این دستگاه ممکن است با آن مواجه شویم گرفتگي مكرر لولههاست که برای رفع آن می بايست سوسپانسيون سلولي يكدست و هموژن باشد.
- تعيين ميزان پروتئين سلول( Protein Determination)
- تعيين ميزان DNA سلول (DNA Determination)
- تعيين ميزان گلوکز مصرفی (Glucose determination)
- تعيين ميزان پروتئين سلول: پروتئین سلول مقياسی از زیست توده (کل مواد سلولی) محسوب میشود. معمولاً محتوای پروتئين يک سلول پستاندارpg/cell 500 -100 است. این اندازهگیریها همچنين در تعیین فعالیت آنزیم خاص مفید است،که معمولاً بیانکننده حداکثر سرعت واکنش اندازهگیری شدة يک آنزیم به کل پروتئین موجود در سلول است. رايجترين روش آزمايش رنگسنجیها روش لوری(Lowry) و برادفورد (Bradford) است. روش برادفورد به دلیل سرعت، حساسیت و دخالت ناچیز دیگر اجزای سلول بر روش لوری برتری دارد. در اين روش به سلولهای ليزشده معرف کوماسی بلو اضافه میشود و در عرض 10 دقيقه رنگ آبی ايجاد میگردد. میتوان توسط يک رنگسنج يا اسپکتوفتومتر آن را اندازهگيری و با پروتئين های استاندارد مقايسه کرد.
- تعيين ميزان DNA سلول : مراحل اجرای این روش شامل ليزشدن سلولها در معرف فلورسانس است. معرف به DNAسلول باند میشود. رديابی فلورسانس با معرفهایی با حساسیت بالا مانند هوخست 33258 يا (DAPI) indole – 4,6- diamidino-2- phenyl صورت می گيرد.
- تعيين ميزان گلوکز مصرفی سلول: رشد سلول را با تغيير در غلظت ترکيبات محيط کشت ميتوان ردیابی کرد. یک روش سنجش غیر مستقیم تعداد سلول، اندازهگیری تغيير در محتوای گلوكز محيط است. از دیگر ترکيبات محيط کشت که میتوان به اين منظور استفاده کرد، اندازهگيری میزان توليد اسيد لاکتيک و يا ميزان مصرف اکسيژن است.
- سنجش گلوکز اکسيداز:ميزان گلوکز سلول با يک آزمايش رنگ سنجی و با کمک دو آنزيم گلوکز اکسيداز و پراکسيداز اندازهگیری میشود.
- در مطالعة سلولهاي سرطاني
- براي تشخيص ردکردن يا ردنکردن بافت پيوندي به انسان يا موجود مورد مطالعه. هر چه تعداد سلولهای زنده در محل پيوند(graft)بیشتر باشد، نشاندهنده موفقیت عمل پیوند است.
- محاسبة ميزان سميت مواد سمي (Toxified) در in vitro و تعيين دوز مناسب دارو.
- محاسبة اثر تخريبكنندگي توكسينها در محيط