متیلاسیون هیستون ها

تاریخچه: ‏

هیستون ها (‏H1، H2A، H2B، H3 و H4) پروتئین های اصلی محافظت شده ای هستند که وظیفه ی ‏فشرده سازی و سازمان دهی‎ DNA ‎کروموزومی را بر عهده دارند. این پروتئین ها اولین بار توسط آلبرت ‏کوسل‎ در سال 1884 نام گذاری شدند. ماهیت این پروتئین ها به شدت قلیایی بوده و اسیدهای آمینه بازی مانند لیزین و آرژنین به فراوانی در هیستون ها یافت می شود. هیستون ها دارای بار مثبت بوده و بنابراین ‏ترتیب میل ترکیبی آن ها با‎ DNA ‎به خاطر وجود بارهای منفی گروه های فسفات زیاد می باشد. ‏پروتئین ‌های هیستونی از زنجیره‌ های طولانی اسیدهای آمینه ساخته شده‌اند. اگر اسیدهای آمینه ‏موجود در زنجیره تغییر کنند، ممکن است شکل هیستون دچار تغییر شود. اگرچه تغییرات هیستون در ‏کل توالی ژنوم رخ می‌دهد، با این وجود انتهای آمینی هیستون‌ها (معروف به دنباله ‌های هیستونی) دچار ‏طیف وسیعی از تغییرات شامل استیلاسیون، متیلاسیون، یوبیکوئیتینه شدن، فسفوریلاسیون، ‏سوموئیلاسیون، ریبوزیلاسیون و سیترولیناسیون می‌شوند. استیلاسیون پروتئین‌های هیستونی یکی از ‏مهم‌ترین فرآیندهای اپی‌ژنتیکی است که به منظور تنظیم بیان ژن‌ها رخ می‌دهد‎.‎‏ استیلاسیون، شارژ ‏مثبت دم های هیستونی را کاهش داده و آن ها را از ساختار‎ DNA ‎که شارژ منفی دارد، دور نگه می دارد. ‏این اتفاق، ساختار کروماتین را اندکی بازتر می کند و رشته ‏DNA‏ را در دسترس فاکتورهای ‏رونویسی و دیگر پروتئین های تنظیم بیان ژن قرار می دهد. در سال 1950، ‏Stedman‏ و همکارانش ‏پیشنهاد كردند كه هیستون ها می توانند به عنوان بازدارنده های كلی بیان ژن عمل كنند و هر نوع سلول ‏در هسته خود نوع متفاوتی از هیستون را داشته باشد. این ایده برای یک توضیح احتمالی در مورد تنوع ‏کهن الگوهای سلولی مشاهده شده در موجودات زنده بود. مطالعاتی که توسط ‏Allfrey‏ (1964)، ‏Kornberg‏ و ‏Thomas‏ (1974) و‏Brownell ‎‏ و ‏Allis‏ (1995) انجام شده اند، تأیید کرد که هیستون ها ‏نقشی اساسی در کنترل دسترسی به پروموترهای ژنی توسط عوامل رونویسی و سایر اجزای دخیل در ‏سنتز ‏RNA‏ دارند. به عنوان مثال، استیلاسیون لیزین‌هایK14 ‎ و‎ K9 ‎در دم هیستون ‎ H3 ‎توسط آنزیم‌های ‏هیستون استیل ترانسفراز‎ (HATs) ‎ به طور کلی به عملکرد صحیح رونویسی مربوط می‌شود. فاکتور های ‏فعال کننده رونویسی به طور همزمان با استیله شدن لیزین هیستون ها فعال می شوند، در حالی که ‏فاکتورهای سرکوب کننده رونویسی با دِاستیله شدن هیستون ها شروع به کار می کنند‎.‎‏ اصلاحات دم ‏های هیستونی در تنظیم بسیاری از فرآیندهای سلول از قبیل فعال کردن یا سرکوب رونویسی، آسیب به ‏DNA‏ و ترمیم آن، تغییر ساختار سه بعدی کروماتین، اتصال به دومین ها، چرخه سلولی و متراکم شدن ‏کروموزوم مشارکت دارند. ‏

انواع روش ها

اکثر مقالات منتشر شده در مورد اصلاحات هیستون بر اساس شواهدی است که با روش های سنتی مانند ‏وسترن بلات، ایمونوهیستوشیمی و نقشه برداری در کل ژنوم ارائه شده است. با این حال، این روش ها ‏وقت گیر بوده و فاقد قابلیت های توان عملیاتی بالا هستند و هنگام بررسی بیش از یک هیستون تغییر ‏یافته، می توانند بسیار پرهزینه باشند. در حال حاضر در تحقیقات اپی ژنتیک برای درک بهتر اصلاحات ‏هیستون از انواع تکنیک ها از جمله رسوب سنجی ایمنی کروماتین(‏ChIP‏) و روش طیف سنجی ‏جرمی (‏MS‏) استفاده می شود.‏

‏1-‏ رسوب سنجی ایمنی کروماتین ‏

رسوب سنجی ایمنی کروماتین (‏ChIP‏) یک تکنیک مبتنی بر آنتی بادی است که ارتباط بین ژنوم و ‏پروتئوم را از طریق اتصال به هیستون ها و فاکتورهای رونویسی ‏متصل به ‏DNA‏ برقرار می کند.با ظهور تکنیک ‎ChIP، سازوکارهای تشخیصی و بیولوژیکی که مبتنی بر پروتئین های هسته ‏ای می باشند به شدت افزایش یافت. این فرایندها عموما در زمینه های بیان ژن، تمایز سلولی یا بروز بیماری می باشند‎.‎‏

‏1- تاریخچه

در سال 1984، ‏Tohn‏ و ‏Gilmour‏ که در آن زمان هر دو دانشجوی کارشناسی ارشد بودند در آزمایشگاه ‏خود توانستند با تاباندن اشعه ‏UV، پروتئین ها را به ‏DNA‏ سلول های زنده باکتری ‏E.Coli‏ به طور ‏کووالان کراس لینک کنند. به دنبال آن با لیز کردن سلول های کراس لینک شده و ایمونوپرسیپیتاسیون ‏آنزیم ‏RNA‏ پلی مراز باکتریایی، آن قسمت از ‏DNA‏ که در ارتباط با انبوهی از ‏RNA‏ پلی ‏مرازها بودند را توانستند با پروب ها شناسایی کنند. در واقع این دو نفر اولین کسانی بودند که روش ‏کروماتین ایمونوپرسیپیتاسیون را برای مطالعه بررسی وضعیت متیلاسیون توسعه دادند. در ادامه، این گروه روش ‏مشابهی را برای مطالعه ارتباط ‏RNA‏ پلی مراز ‏II‏ یوكاریوتی بر روی ژن های شوك حرارتی ‏Drosophila‏ ‏اعمال كردند. این روش مجدد در سال 1988 توسطSolomon ‎‏ و ‏‎ Alexander Varshavskyاصلاح شد. در روش اصلاح شده به جای تابش ‏UV‏، از فرمالدهید به عنوان عامل اتصال متقابل استفاده شد و برهم کنش بین ژن ‏های ‏Drosophila hsp70‎‏ با هیستون ‏H4‎‏ و ‏RNA‏ پلیمراز ‏II‏ را مطالعه کردند. سلول ها قبل و بعد از ‏شوک گرمایی با فرمالدهید تیمار شدند. سپس ‏DNA‏ تحت برش یا هضم آنزیم های محدود شونده قرار ‏گرفت. مجموعه پروتئین-‏DNA‏ متقاطع حاوی هیستون ‏H4‎‏ یا ‏RNA‏ پلیمراز ‏II‏ با استفاده از آنتی بادی ‏های اختصاصی رسوب یافتند. سپس، کمپلکس های پروتئین-‏DNA‏ در رسوب حرارت دیده تا پیوند ‏متقابل کووالانسی برگردانده شود، ‏DNA‏ تخلیص شده و بعدا با روش ساترن بلات مورد آنالیز قرار ‏گرفت. علاوه بر این، در سال 1996 ‏Hecht و Grunstein‏ پرتکل یاد شده را با استفاده از ‏PCR‏ برای مطالعه تعامل ‏پروتئین های SIR‏ در ساکارومایسس سرویزیه ‏‎اصلاح کردند. ‏Rundlett‏ و همکارانش، در سال ‏‏1998 روش تشخیص ‏PCR‏ را در ‏ChIP‏ اضافه کردند و تغییرات هیستون را در مکان های خاص ‏ساکارومایسس سرویزیه‎ ‎بررسی کردند. تقریبا به طور همزمان، روش ‏ChIP‏ با بکارگیری ‏UV‏ و سپس با فرمالدهید برای کراس لینک کردن در سلول های پستانداران بهینه سازی شد.‏

2- پروتکل آزمایشگاهی

مراحل کلی تکنیک ‏ChIP‏ بدین گونه می باشد: ‏
‏1-‏ آماده سازی کروماتین
• جمع آوری سلول ها.‏
• افزودن فرمالدهید (مخصوص ‏Cross linking ChIP‏)‏
• لیز سلول ها و تجزیه کروماتین توسط دستگاه سونیکیشن (امواج صوتی پر انرژی) یا هضم ‏نوکلئازی و یا اشعه ‏UV‏.‏
‏2- ایمونوپرسیپیتاسیون پروتئین-‏DNA‏ با آنتی بادی ویژه آن. ‏
‏3- آنالیز توالی ‏DNA‏ به دست آمده به کمک تکنیک هایی مانند توالی یابی‎ ‎،‎ ‎میکرواری‎ ‎و‏‎ PCR

3-‏ آماده سازی کروماتین

اگرچه ‏ChIP‏ با مرحله اتصال متقابل با فرمالدهید پدید آمده است اما می توان آن را بدون مرحله اتصال ‏متقابل نیز انجام داد. به طور کلی دو نوع ‏ChIP‏ به نام های‏‎ XChIP‎ ‎وNChIP ‎‏ وجود دارد. در سال ‏‏1988،NChIP ‎‏ برای اولین بار توسط ‏Hebbes‏ و همکارانش توصیف شد. تفاوت اساسی این دو روش در ‏شروع آماده سازی کروماتین است. در ‏XChIP‏ کروماتین با فرمالدهید تثبیت شده و با دستگاه سونیکیشن ‏برش داده می شود، درحالی که در ‏NChIP‏ کروماتین های دست نخورده سلولی با نوکلئاز میکروکوکی ‏برش داده می شود.‏

2- Cross_linked ChIP‏‏

اساسا تکنیک ‏XChIP‏ در تهیه نقشه برداری از مکان های قرارگیری فاکتورهای رونویسی یا دیگر پروتئین ‏های مرتبط با کروماتین مناسب است و فرمالدهید و اشعه ‏UV‏ برای ایجاد پیوند متقاطع کروماتین جهت ‏شروع پروسه ‏XChIP‏ به کار می رود. پیوند متقاطع به نوع سلول یا بافت، غلظت بهینه مورد استفاده و ‏مدت زمان مجاورت فرمالدهید بستگی دارد. پیوند بیش از حد منجر به افزایش رسوب قطعات غیر مرتبط ‏و آلوده کننده واکنش می گردد. از سوی دیگر، پیوند متقاطع ناکافی باعث تثبیت ناقص و تجزیه نامناسب ‏DNA‏ می شود. در مرحله بعد، کروماتین کراس لینک شده توسط دستگاه سونیکیشن برش خورده و ‏قطعات 300 تا 1000 ‏‎ bp‏ فراهم می کند. توجه داشته باشید که همواره می بایستی از کالیبره بودن دستگاه سونیکیشن اطمینان یافت تا قطعات ‏DNA‏ با طول مناسب فراهم شود. کروماتین خرد شده حاصل از سونیکیشن را می توان تا 3 ماه در دمای 80- ‏درجه سانتی گراد ذخیره کرد. سپس مراحل بعدی ‏ChIP‏ تا خالص سازی و آنالیز کمپلکس در ارتباط با ‏DNA‏ مورد نظر صورت می گیرد.‏ 

مزایای روش:

‏1) برای به دست آوردن فاکتورهای رونویسی و یا هر پروتئینی که با کروماتین ارتباط ضعیفی داشته ‏باشد، مناسب هستند.‏
‏2) به طور کلی، به میزان سلول ها و آنتی بادی کمتری نسبت به ‏NCHIP‏ نیاز دارند.‏
‏3) این روش احتمال بازآرایی کروماتین در حین آماده سازی و رسوب را به حداقل می رساند.‏

معایب روش:‏

‏1) بازدهی پایین تری در به دست آوردن کروماتین و پروتئین دارند که به علت شکسته شدن اپی توپ ‏های پروتئینی که در مواجه با فرمالدهید قرار می گیرند رخ می دهد و آنتی بادی ها قادر به شناسایی این ‏اپی توپ ها نیستند.‏
‏2) به وجود آمدن کروماتین هایی با اندازه های متغیر به علت برش تصادفی با سونیکیشن انجام می گیرد.‏
‏3) ایجاد نتایج مثبت کاذب به علت تثبیت پروتئین های ناپایدار به کروماتین
‏4) در برخی موارد، مجموعه پروتئین_‏DNA‏ باید به وسیله سانتریفیوژ ‏isopycnic‏ از طریق سدیم کلراید ‏تخلیص گردد که نیازمند صرف وقت و هزینه بسیاری است.‏

3- روش ‏NChIP

روش ‏NChIP‏ برای نقشه برداری از اصلاح کننده های هیستونی از ‏DNA‏ هدف مناسب می باشد، برای ‏شروع ‏NChIP‏ از کروماتین دست نخورده سلولی استفاده می شود. از آن جایی که هیستون ها به دو ‏رشته ‏DNA‏ پیچیده می شوند تا نوکلئوزوم ها را تشکیل دهند پس به ‏DNA‏ متصل هستند. سپس ‏کروماتین با نوکلئاز میکروکوکی برش خورده و این برش در مکان های رابط بین نوکلئوزوم ها صورت ‏می گیرد و قطعات ‏DNA‏ از یک نوکلئوزوم به طول (200 ‏bp‏) تا پنچ نوکلئوزوم به طول (1000 ‏bp‏) را ‏فراهم می کند و سپس مراحل بعدی ‏ChIP‏ تا خالص سازی و آنالیز کمپلکس در ارتباط با ‏DNA‏ موردنظر ‏صورت می گیرد. تمام مراحل تخلیص ‏DNA‏ هسته باید روی یخ و یا در دمای ‏‎4°C‎‏ انجام شود.‏

مزایای روش:‏

‏1) بازدهی بالایی در به دست آوردن کروماتین و پروتئین به علت اختصاصیت بالای آنتی بادی در اتصال ‏به کروماتین فیکس نشده دارند.‏

معایب روش: ‏

‏1) معمولا برای پروتئین های غیر هیستونی قابل استفاده نیستند.‏
‏2) پروتئین ها ممکن است در طول آماده سازی و رسوب کروماتین بازآرایی شوند.‏
‏3) در حین آماده سازی، امکان هضم انتخابی در نواحی خاصی از کروماتین وجود دارد.‏

4- ایمونوپرسیپیتاسیون پروتئین-‏DNA‏

‏پس از آماده سازی کروماتین (پیوند متقاطع یا دست نخورده)، هیستون های تغییر یافته توسط آنتی بادی ‏های اختصاصی رسوب داده می شوند. آنتی بادی ها می توانند مونوکلونال، پلی کلونال یا الیگوکلونال ‏مخصوص پروتئین مورد نظر باشند. مقدار مناسب آنتی بادی را می توان با آزمایش های اولیه ‏ایمونوپرسیپیتاسیون تعیین کرد. مقدار بیش از حد آنتی بادی باعث رسوب بیش از حد ‏DNA‏ می شود. ‏استفاده از نمونه کنترل برای اطمینان از عدم وجود اتصالات غیر اختصاصی ضروری است. بازدهی ‏ایمونوپرسیپیتاسیون به میزان آنتی سرم استفاده شده و میل پیوندی آنتی بادی به اپی توپ آن بستگی ‏دارد. پس از رسوب دهی ایمنی، شستشو برای حذف کروماتین های غیر اختصاصی و پروتئیناز ‏K‏ و ‏حرارت برای تجزیه پروتئین ها انجام می شود. ‏DNA‏ نیز به وسیله روش فنل-کلروفرم و یا کیت های ‏تخلیص استخراج و آماده آنالیز است.‏

شناسایی و تعیین توالی ‏DNA

آخرین مرحله ‏ChIP، تجزیه و تحلیل ‏DNA‏ با روش های پیشرفته مولکولی است. سه تکنیک اصلی و ‏رایج برای شناسایی تغییرات هیستونی شامل ‏ChIP- qPCR‏ (رسوب ایمنی کروماتین همراه با ‏PCR‏ ‏کمّی)، ‏ChIP-on-chip‏ (رسوب ایمنی کروماتین همراه با میکرواری) و ChIP–Seq‏ (رسوب ایمنی ‏کروماتین همراه با تکنیک های توالی یابی با توان بالا) می باشد. هر سه تکنیک در سنجش رسوب ایمنی ‏کروماتین مشترک هستند، سپس ‏DNA‏ می تواند به روش های مختلفی ارزیابی شود.‏

ChIP-qPCR‏

ترکیب ‏qPCR‏ با روش ‏ChIP‏ می تواند غلظت ‏DNA‏ نمونه های متعدد را با تجزیه و ‏تحلیل شدت سیگنال فلورسنت متناسب با مقدار آمپلیکون پس از اتمام روش سنجش رسوب ایمنی ‏کروماتین (‏ChIP‏) و تخلیص نمونه، تعیین کند. در صورت وجود محل های اتصال ژنومی شناخته شده، ‏می توان پرایمرها را برای ‏qPCR‏ طراحی کرد تا مشخص شود که مکان های شناخته شده به طور خاص ‏با رسوب دهی ایمنی غنی شده اند. این روش برای کمّی سازی ‏H3‎‏ و ‏H4‎‏ استیله در مناطق مختلف یک ‏مکان خاص بسیار مفید است. متداول ترین رنگ فلورسنت برای شناسایی امپلیکون، سایبرگرین است که ‏به ‏DNA‏ دو رشته ای متصل می شود. برای مقایسه نتایج نمونه ‏DNA‏ حاصل از رسوب دهی ایمنی با ‏نمونه کنترل، نمونه باید با استفاده از استانداردها نرمالیزه شوند. برای این منظور از یک ناحیه ژنومی ثابت ‏به عنوان کنترل داخلی انتخاب می شود. در نهایت آنالیز کمّی با استفاده از مقدار ‏Ct‏ انجام می شود. ‏اگرچه این روش نمی تواند یک موقعیت ژنی خاص یا ناحیه مورد نظر را با جزئیات ترسیم کند، اما می ‏تواند میزان نسبی اتصال پروتئین در نمونه های مختلف را تجزیه و تحلیل کند. حساسیت شناسایی ‏DNA‏ ‏هدف در این روش از ‏ChIP‏ استاندارد بیشتر است. علاوه بر این، این روش در مقایسه با سایر رویکردهای ‏ChIP‏ (حدود 108) به تعداد سلول های کمتری (حدود 106 × 3) نیاز دارد.‏

ChIP-on-chip‏

روش ‏ChIP-on-chip‏ که به عنوان روش ‏ChIP-chip‏ نیز شناخته می شود، ترکیبی ‏از رسوب ایمنی کروماتین و میکرواری ‏DNA‏ است که به منظور بررسی برهم کنش های بین ‏DNA‏ و ‏پروتئین ها در سلول مورد استفاده قرار می گیرد. کروماتین اصلاح شده ابتدا با رسوب ایمنی کروماتین ‏خالص می شود و با آنتی بادی اختصاصی، پیوند متقاطع می دهد. سپس ‏DNA‏ تکثیر شده و با یک رنگ ‏فلورسنت برچسب گذاری می شود. ‏ChIP DNA‏ دارای برچسب رنگی با ‏DNA‏ کنترل که با رنگ دیگری ‏نشاندار شده بر روی یک میکرو اری هیبرید (ترکیب) می شود. آنالیز شدت سیگنال دریافتی، ‏مکان های اصلاح هیستونی را تعیین می کند. بیشتر ‏ChIP‏ های آزمایشگاهی از آنتی بادی های پلی کلونال استفاده ‏می کنند که از نظر اختصاصیت بین دسته ها متفاوت است. آنتی بادی مورد استفاده برای سنجش رسوب ‏ایمنی باید دارای اختصاصیت و میل پیوندی بالایی باشد تا اپی توپ آن را در محلول آزاد و همچنین در ‏شرایط پایدار تشخیص دهد و از پس زمینه های غیر اختصاصی در روش ‏ChIP‏ جلوگیری شود. به طور ‏کلی ‏DNA‏ ژنومی به عنوان کنترل ورودی و نمونه های فاقد آنتی بادی یا ایمونوگلوبولین ‏‎ IgGبه عنوان ‏کنترل منفی استفاده می شود.‏

ChIP–Seq

ترکیبی از ‏ChIP‏ با تکنیک های توالی یابی برای شناسایی مکان های اتصال پروتئین ‏های مرتبط با ‏DNA‏ است. ChIP-seqیکی از اولین برنامه های تعیین توالی نسل بعدی ‏(‏‎(NGS‎‏ بود که ‏در اواسط دهه 2000 توسعه یافت. در سال های اخير برای بررسی پروفايل پروتئين های متصل شده به ‏DNA‏ در مقياس ژنومی و همچنين تغييرات پروتئين های هيستونی و نوكلئوزوم ها، از تكنيك ‏‎ChIP-‎seq‏ استفاده مي شود. به اين ترتيب كه پس از جداسازی و تفكيك پروتئين ها با استفاده از رسوب دهی ‏ايمنی كروماتينی از ‏DNA، مولكول های ‏DNA‏ به كمك روشNGS ‎‏ توالی يابی می گردند. یک روش ‏معمول در تجزیه و تحلیل ‏ChIP-Seq‏ به دست آوردن پروفایل ‏ChIP-Seq‏ برای یک نمونه آزمایشی (نمونه ‏بیماری) و یک نمونه مرجع (نمونه سالم) و مقایسه آن ها برای شناسایی تفاوت در الگوهای اصلاح ‏هیستون است.‏

مزایای روش:‏

‏1) در مقایسه با ‏ChIP-on-chip، ‏ChIP-Seq‏ امکان تفکیک پذیری بهتری در سطح جفت بازها، آرتیفکت ‏کمتر و پوشش دهی بهتری فراهم می کند. ‏
‏2) ‏ChIP-seq‏ دارای رزولوشن تک نوکلئوتیدی است.‏
‏3) مقادیر کمتری نمونه برای ‏ChIP-Seq‏ نیاز است.‏

معایب روش:‏

‏1) محدودیت اصلی ‏ChIP-seq‏ کم دسترس بودن دستگاه های تعیین توالی و هزینه بر بودن این فرایند می باشد.‏
‏2) از آنجا که ‏ChIP-seq‏ از آنتی بادی در رسوب ایمنی استفاده می کند، کیفیت داده ها به کیفیت آنتی ‏بادی بستگی دارد. کیفیت آنتی بادی باید تایید شود که چنین فرآیندهایی سخت و زمان بر است.‏

آنالیز داده:‏

همانند بسیاری از روش های توالی یابی با توان بالا، ‏ChIP-seq‏ مجموعه داده های بسیار بزرگی را تولید ‏می کند که برای آن ها روش های آنالیز محاسباتی مناسب مورد نیاز است. برای استخراج داده های معنی ‏دار از توالی خام، تجزیه و تحلیل داده های ‏ChIP-seq‏ باید:‏
‏* مناطق ژنومی – “قله ها ‏” – جایی که ‏TF ‏متصل می شود یا هیستون ها اصلاح می شوند را ‏شناسایی کند.‏
‏*کمّی سازی و مقایسه اتصال یا اصلاح هیستون بین نمونه ها را انجام داد.‏
‏*ارتباط بین وضعیت کروماتین و بیان ژن را توصیف کند.‏
‏1. در ابتدا، توالی های خوانده شده از ‏ChIP-seq‏ برای ارزیابی کیفیت خوانش ها آنالیز می شوند.‏
‏2. پس از معیارهای کیفیت، خوانش ها به ژنوم مرجع نقشه یابی‏ شده و پیک ها فراخوانی می شوند. ‏در مقایسه با خوانش های ورودی، مناطق ژنومی که به طور معناداری غنی از خوانش های ‏ChIP‏ ‏هستند، به عنوان قله شناسایی می شوند. سایر مناطق ژنومی به عنوان زمینه غیر اختصاصی در نظر ‏گرفته می شوند. پیک های فراخوانی شده نشان دهنده اصلاح هیستون و مناطق اتصال دهنده پروتئین یا ‏DNA‏ است.‏
برای پیش بینی نواحی متصل به ‏DNA‏ از داده های خوانش ‏ChIP-Seq، ابزارهای فراخوانی پیک‏ ایجاد ‏شده اند. یکی از مشهورترین آن ها ‏MACS‏ است که به صورت تجربی میزان تغییر برچسب های ‏ChIP-‎Seq‏ را مدل سازی می کند و از آن برای بهبود وضوح مکان های اتصال پیش بینی شده استفاده می کند. ‏MACS‏ برای قله های با وضوح بالاتر بهینه شده است، در حالی که الگوریتم متداول دیگر ‏SICER‏ به ‏گونه ای طراحی شده است که دامنه های وسیع تر کروماتین از چندین کیلوباز تا چندین مگاباز را فرا می گیرد. ‏SICER‏ برای مطالعه نقاط هیستونی در طول ژن کارآمدتر است. روش محاسباتی دقیق تر BCP برای ‏بررسی  پیک های شارپ و گسترده تر، از کارایی بالاتری برخوردار است. زیر مجموعه ای از نرم افزار های ‏موجود برای نقشه برداری‏ و فراخوانی پیک ها به طور خلاصه در جدول زیر ذکر شده است.‏

ابزارهای نقشه یابی خوانش های کوتاه

نام الگوریتم

سایت اینترنتی جهت دسترسی

BWA

http://bio-bwa.sourceforge.net

Bowtie

http://bowtie-bio.sourceforge.net

MAQ

http://maq.sourceforge.net

ابزارهای فراخوانی پیک

MACS

http://liulab.dfci.harvard.edu/MACS

BCP

http://rulai.cshl.edu/BCP

PeakSeq

http://info.gersteinlab.org/PeakSeq

ZINBA

http://code.google.com/p/zinba

یکی از چالش های محاسباتی، شناسایی پیک های افتراقی است که تفاوت های قابل توجهی را در دو ‏سیگنال ‏‎ ChIP-seq‏ تشخیص می دهد. ابزارهای فراخوانی پیک، دو سیگنال ‏ChIP-seq‏ را تقسیم می کند ‏و پیک های افتراقی را با استفاده از مدل های مارکوف پنهان ‏ شناسایی می کنند. ‏ODIN‏ و ‏ChIPDiff‏ ‏نمونه هایی از ابزارهای فراخوانی پیک جهت افتراق دو سیگنال هستند.‏‎ ‎برای کاهش خطا در نتایج حاصل از ‏ChIP-Seq‏، اختصاصیت آنتی بادی های بکار رفته، از طریق ایمونوپرسیپیتاسیون (IP) با چندین کنترل مقایسه می شود. ‏نمونه کنترل انتخابی اغلب ‏DNA‏ حاصل از کروماتین قبل از ‏IP‏ (تحت عنوان کنترل ورودی)، ‏IP‏ بدون آنتی بادی ‏‏(‏mock‏) و یا ‏IP‏ غیر اختصاصی (مثلا ‏IP‏ علیه ایمونوگلبولین ‏G‏) می باشد.‏
کنترل کیفی: یکی از ابزارهای متداول برای این نوع کنترل کیفی، ‏FastQC‏ نام دارد.‏
برای اطمینان از نتایج به دست آمده از ‏ChIP-seq، باید فرایند کنترل کیفی انجام و موارد زیر بررسی می شوند:‏
Non-redundant fraction‏: مناطق با پیچیدگی کم باید حذف شوند زیرا ممکن است با نقشه برداری در ‏ژنوم مرجع تداخل داشته باشند. ‏
Fragments in peaks‏: منظور آن است که نسبت خوانش هایی که در پیک ها قرار دارند به خوانش هایی که در پیک واقع نشده ‏اند محاسبه شود.‏

پایگاه های داده

ChIP-Atlas‏:

یک پایگاه داده یکپارچه و جامع به منظور استفاده از داده های عمومی ‏ChIP-seq‏ است. ‏ChIP-Atlas‏ تقریباً تمام داده های عمومی ‏ChIP-seq‏ ارسال شده به ‏SRA (آرشیو خوانش توالی ها) ‏درNCBI ‎، ‏DDBJ‏ یا ‏ENA‏ را پوشش می دهد و محتوای آن براساس بیش از 144000 آزمایش گردآوری شده است.‏

پایگاه ‏ENCODE‏

شامل مجموعه گسترده ای از داده های ژنومی با استفاده از تکنولوژی هایی نظیر ‏ChIP-seq، هضم ‏DNA ‏و سایر تکنیک هاست. هر کدام از این داده ها برای تصویرسازی و بارگیری بر ‏روی ‏UCSC Genome Browser‏ قرار داده شده اند. 

پایگاه ‏ROADMAP epigenome database

هدف این کنسرسیوم ایجاد یک منبع عمومی از داده های ‏اپی ژنومی انسان شامل نقشه برداری از متیلاسیون ‏DNA، تغییرات هیستونی، قابلیت دسترسی به ‏کروماتین و رونوشت های کوچک ‏RNA‏ در سلول های بنیادی و بافت های اولیه ازمایشگاهی است.‏‎ 

Cistrome DB‏

پایگاه داده ای است که در آن داده های ‏ChIP-seq‏ گردآوری و پردازش شده است. این ‏یک مکمل خوب برای پروژه های بزرگ نظیرENCODE ‎‏ و ‏Roadmap Epigenomics‏ است؛ زیرا داده ‏های بسیاری از مطالعات کوچک تر را جمع آوری می کند. همچنین امکان بارگیری فایل ها از ‏cistrome‏ ‏وجود دارد.‏‎

GTRD‏

کامل ترین مجموعه از داده های ‏ChIP-seq‏ می باشد که به طور یکنواخت برای شناسایی مکان ‏های اتصال فاکتور رونویسی برای انسان و موش پردازش شده است.‏

محدودیت های روش های مبتنی بر ‏ChIP

در حال حاضر تکنیک‎ ChIP ‎به عنوان یک روش کلیدی در تهیه نقشه موقعیت هیستون های تغییر یافته ‏به کار می رود. با وجود همه مزایای روشChIP ‎، یکسری معایب اصلی وجود دارد. محدودیت عمده این ‏است که به دلیل از دست رفتن نمونه در طول فرآیند ‏ChIP، تعداد سلول های ایده آل مورد نیاز برای ‏سوبسترای اولیه 106-107 است. این تعداد سلول یک چالش جدی برای مطالعه اپی ژنتیک در طی فرآیندهای تمایز ‏سلول های بنیادی، رشد جنین و رشد تومور است، زیرا برداشتن مقدار زیادی نمونه از سلول های اولیه یا ‏نمونه برداری از بافت بیمار دشوار است. علاوه بر این، پروسه ‏ChIP‏ زمان بر است (به طور معمول 2 تا 7 ‏روز) و باعث از دست رفتن مواد، آلودگی نمونه و خطاهای آزمایشی می گردد. در حال حاضر توسعه این ‏تکنیک به سمتی پیش می رود که پروسه‎ ChIP ‎به سلول کمتری نیاز داشته باشد و همچنین انجام شدن ‏آن در بازه زمانی کوتاه صورت گیرد‎.‎

روش های اصلاح شده مبتنی بر ‏ChIP

امروزه برای بهبود سنجش تعداد سلول ها و مدت زمان انجام آن، چندین روش ‏ChIP‏ توسعه یافته اند، ‏که می توان به موارد زیر اشاره کرد:‏
‏ ‏Carrier ChIP (CChIP), quick quantitative ChIP (Q2 ChIP), MicroChIP (µChIP), Fast ChIP, ‎Matrix ChIP, AutoChIP.‎ انجام روش ‏Carrier-ChIP) CChIP‏) به 100 سلول نیاز دارد و انجام ان 2-3 روز به طول می انجامد. ‏استفاده از کروماتین های حامل (به عنوان مثال از ‏Drosophila‏)، رسوب کروماتین سلول هدف را تسهیل ‏می کند. در این روش، کروماتین سلول هدف می تواند با استفاده از پرایمرهای بسیار خاص، از کروماتین ‏های حامل پس زمینه خارجی متمایز شود.‏
به عنوان یک روش جایگزین، ‏Q2 ChIP‏ روشی است که با استفاده از 1000 سلول برای ‏ایمونوپرسیپیتاسیون هیستون و فاکتورهای رونویسی مناسب است. بنابراین بسیاری از نمونه های ‏کروماتین می توانند به صورت موازی تهیه و ذخیره شوند. کاهش تعداد مراحل، افزایش ویژگی آنتی بادی ‏به اپی توپ هدف، افزایش نسبت سیگنال به نویز و تجزیه و تحلیل تغییرات متعدد اپی ژنتیکی از مزایای ‏این روش است.‏ChIP ‎‏ ‏Q2‎‏ تنها در یک روز قابل انجام می باشد.‏
همچنین، روش ‎ μChIPیکی دیگر از روش های بهبود یافته مبتنی بر ‏ChIP‏ است که در آن كروماتین ‏معمولاً از 1000 سلول تهیه می شود و حداكثر 8 تراشه را می توان به طور موازی و بدون حامل انجام ‏داد. این سنجش برای مطالعات گسترده ژنومی و تجزیه و تحلیل تغییرات متعدد اپی ژنتیکی نیز کاربرد ‏دارد.‏
از سوی دیگر، با تلاش برای کاهش زمان کل پروتکل، تکنیک دیگری به نام ‏‎ Fast-ChIPتوسعه یافته است. ‏Fast-ChIP‏ سنجش ‏اولیه ‏ChIP‏ را در دو مرحله بهبود بخشیده است و به شناسایی عوامل مختلف اپی ژنتیکی در بیش از یک ‏منطقه یا حتی در کل ژنوم کمک می کند. در مرحله اول، برای اتصال موثر آنتی بادی-پروتئین، آنتی ‏بادی ها در حمام اولتراسونیک انکوبه می شوند و زمان انکوباسیون به 15 دقیقه کاهش می یابد. ثانیاً، ‏شستشوی کمپلکس ‏ChIP، تغییر پیوند متقاطع و هضم پروتئین های متصل شده توسط پروتئیناز ‏K، ‏زمان کل آماده سازی الگو های آماده ‏PCR‏ را به 1 ساعت کاهش می دهد.‏
Matrix-ChIP‏ یک آزمایش مبتنی بر ‏ChIP‏ بر اساس میکروپلیت است که برای افزایش کارایی ‏ChIP‏ و ‏ساده سازی آن توسعه یافته است. میکروپلیت حاوی 96 چاهک و با آنتی بادی های بی حرکت پوشیده ‏شده است.تمام مراحل در چاهک های میکروپلیت انجام می شود و امکان اتوماسیون را فراهم می کند. ‏این روش 96 تست‎ ChIP ‎را برای هیستون و پروتئین های مختلف متصل به‎ DNA ‎در یک روز امکان ‏پذیر می کند. این روش از حساسیت بالایی برخوردار است. ‏
در روش اصلاح شده‎ microfluidic ChIP (‘‘AutoChIP’’) ‎ایمونوپرسیپیتاسیون مجموعه پروتئین-‏DNA‏ ‏هدف در کانال های کوچک میکروسیال انجام می شود. در این روش نوین جمع آوری سلول، لیز، تکه تکه ‏شدن کروماتین، رسوب ایمنی و شستشو بر روی یک تراشه کوچک انجام می شود. متعاقب انجام ‏PCR، ‏آنالیز تغییرات هیستونی با تعداد کمی سلول (50 سلول) در تقریبا عرض 8 ساعت صورت می پذیرد.‏

‏تکنیک طیف سنجی جرمی

طیف سنجی جرمی ابزاری قدرتمند برای آنالیز کمّی ‏تغییرات جدید هیستون ها پس از ترجمه است. با این روش ماهیّت تغییرات هیستونی مورد ‏بررسی قرار می گیرد و اغلب به عنوان استاندارد طلایی برای شناسایی و تعیین مقدار پروتئین در ‏نظر گرفته می شود. طیف سنج های جرمی نسبت جرم به بار (‏m/z‏) یون ها را در فاز گاز اندازه ‏گیری می کنند. در مورد پروتئین ها و پپتیدها، یونیزاسیون و انتقال آنها به فاز گاز توسط منابع ‏یونی جایگزین به دو صورت حاصل می شود: (1) یونیزاسیون لیزر به کمک ماتریس‏ ‏(‏‎(MALDI‎‏ ‏‏(2) یونیزاسیون الکترو اسپری ‏(‏ESI‏) از طریق سیستم کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (‏HPLC‏). از خروجی مقادیر ‏m/z‏ از طیف سنجی جرمی می توان برای تعیین بسیار دقیق جرم ‏پروتئین یا پپتید استفاده کرد. سپس، این اطلاعات با طیف سنجی جرمی متوالی‏ (‏MS/MS‏) ‏ترکیب می شود تا شناسایی بدون ابهام توالی پپتید و مهم تر از همه مکان دقیق هیستون تغییر ‏یافته موجود را امکان پذیر کند. ‏MS/MS‏ با جداسازی یون پیش ساز اختصاصی و القای تکه تکه ‏شدن آن به یک سری یون های محصول انجام می شود. مقادیر ‏m/z‏ برای این یون ها اندازه گیری ‏و به منظور تعیین هویت در توالی پروتئین ها در یک پایگاه داده ترسیم می شود. علاوه بر این، ‏موقعیت اسید آمینه ای که اصلاح شده است را می توان مشخص کرد.‏

مراحل اصلی طیف سنجی جرمی : ‏

‏1-‏ استخراج هیستون ها از نمونه بافت یا کشت سلولی
‏2-‏ جداسازی بیشتر توسط ‏SDS-PAGE‏ ‏
‏3-‏ هضم پروتئاز
‏4-‏ جدا شدن پروتئین ها با استفاده از تریپسین ‏
‏5-‏ ‏انجام کروماتوگرافی فاز معکوس
‏6-‏ آنالیز داده های ‏MS
آنالیز داده: فایل های خام طیف سنجی جرمی به نرم افزار وارد می شوند تا یکپارچه سازی نواحی ‏peak‏ را ‏انجام دهد.‏‎(https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family) EpiProfile ‎‏ یک نرم افزار محاسباتی ‏دقیق برای تعیین کمّیت هیستون ها و شناسایی تغییرات هیستون مرتبط با بیماری است. ورودی ‏EpiProfile‏ مقادیر ‏m/z‏ و وضعیت شارژ پپتیدها است. با آگاهی از زمان ماند ‏شستشوی کروماتوگرافی، ‏نواحی پیک پپتیدهای شناخته شده هیستون با اطمینان بالایی استخراج می شوند. ‏Skyline‏ یک نرم افزار ‏ایده آل دیگر برای این منظور است.‏‎ Skyline ‎‏(‏http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline‏) ‏یک برنامه تحت ویندوز است که روش های پروتئومیکس و آنالیز کمّی داده های حاصل از طیف سنجی ‏جرمی را بررسی می کند. ‏Mascot‏ نیز ابزار دیگری است که برای شناسایی هیستون های تغییر یافته شده ‏ناشناخته پیشنهاد می شود.‏
با اینکه طیف سنجی جرمی امکان مشاهده کلی تغییرات هیستون را فراهم می کند ولی محل پروتئین ‏های هیستون در ارتباط با ژنوم ناشناخته است، چیزی که با آزمایش های ‏ChIP‏ امکان پذیر است. فناوری ‏های جدید در تلاشند تا شکاف بین این دو روش را پر کنند. از ترکیب دو تکنیک ‏ChIP‏ و طیف سنجی ‏جرمی برای ارزیابی تغییرات هیستون با اتصال متقابل پروتئین برومودوماین (‏MSL-3‎‏) به کروماتین و سایر ‏پروتئین های متقابل استفاده شده است که سپس تحت بررسی با طیف سنجی جرمی قرار می گیرند. این ‏روش به این دلیل منحصر به فرد است که اجازه می دهد پروتئین های واکنشگر با میل ترکیبی پایین با ‏استفاده از طیف سنجی جرمی بر روی الگوی کروماتین دست نخورده حفظ و شناسایی شوند، در حالی که ‏به طور همزمان امکان تعیین ویژگی اصلاحات در پروتئین های هیستونی را فراهم می کند. بنابراین، ‏تحقیقات آینده با هدف ادغام روش طیف سنجی جرمی با تکنیک های ژنومیک انجام خواهد شد.‏

نتیجه گیری

در این مقاله، تکنیک های رایج برای آنالیز اطلاعات توالی یابی متیلاسیون ‏DNA‏ و اصلاحات هیستونی ‏به تفصیل شرح داده شد. متداول ترین متدهای مورد استفاده در تشخیص متیلاسیون ‏DNA‏ مبتنی بر ‏هضم آنزیمی، تقویت میل پیوندی و تیمار بی سولفیت می باشند که با تکنیک های میکرواری و توالی یابی ‏همراه می شوند. البته امروزه رویکردهای مبتنی بر آنزیم محدود کننده و تقویت میل پیوندی ‏جزو دسته توان عملیاتی پایین در نظر گرفته شده و به اندازه سایر تکنیک ها محبوبیت ندارند. هم چنین ‏پایپلاین ها و ابزارهای جدیدی برای تفسیر آن ها توسعه نمی یابند. انتخاب یک تکنیک مناسب به ‏سوالات پژوهشی مطالعه، برآورد هزینه، مقدار ‏DNA‏ اولیه وابسته می باشد. به عنوان مثال، برای مطالعات ‏در مقیاس گسترده در پستانداران، روش های ‏MeDIP‏ و ‏RRBS‏ بر ‏WGBS‏ ارجح هستند زیرا امکان ‏مقایسه چندین نمونه با هزینه محدود و اطلاعات کافی از مناطق غنی از ‏CpG‏ فراهم می کنند. در ‏جمعیت های سلولی نادر، کمتر بودن میزان ‏DNA‏ اولیه مورد استفاده اهمیت ویژه ای دارد.‏
آنالیز های بررسی متیلاسیون ‏DNA‏ علاوه بر آگاهی بخش درباره فرآیند های بیولوژیک، پنجره ای به ‏سوی درمان بیماری های مرتبط با الگوهای غیرنرمال اپی ژنتیک نیز باز می کند. برخی نتایج بررسی ‏متیلاسیون ‏DNA‏ نیز سبب فراهم آمدن الگو هایی از اپی ژنوم می شود که پیش آگهی یا نشانی از بروز ‏بیماری خاصی را قابل پیش بینی می کند. ارزیابی تغییرات هیستون ها در لوکوس های ژنی خاص نیز از ‏طریق ‏CHiP-qPCR‏ و ‏CHiP-seq‏ نمایی از وضعیت اپی ژنوم هر نمونه را گزارش می کند. به طوری ‏که گاهی با یافتن اختلال در عملکرد اتصال یک فاکتور رونویسی پروتئینی به ژن مربوطه امکان اصلاح آن ‏به روش های جایگزین وجود داشته باشد. آنالیز سریع هیستون ها از طریق طیف سنجی جرمی نیز چشم ‏اندازی از وضعیت تغییرات پس از ترجمه‏ را فراهم می کند و شاید اختلال در این تغییرات سبب ‏برهم خوردن تنظیم بیان بسیاری ژن ها گردد. ‏

 

این مطلب را پسندیدید؟

-

به اشتراک بگذارید

Share on facebook
Share on twitter
Share on linkedin
یک پاسخ بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.فیلد هایی که با علامت ستاره 8 مشخص شده اند، الزامی هستند

X