جدول محتوا

اپی ژنومیکس

جدول محتوا

مقدمه

فرآیند های اپی ژنومیک با تغییر ساختار فضایی کروماتین به کنترل بیان ژن می پردازند. به طوری که ژن هایی که بیان فعال داشته باشند عموما در نواحی در دسترس کروماتین قرار گرفته اند درحالی که ژن هایی که از نظر بیان خاموش باشند اغلب در مناطق غیر قابل دسترس کروماتین جای دارند. بر همین اساس به مجموعه تغییراتی که در بخش DNA یا پروتئینی کروماتین رخ می دهد و ساختار آن را تحت تاثیر قرار می دهد، اپی ژنوم گفته می شود. در همین خصوص، استیلاسیون توالی اسیدهای آمینه هیستون ها همبستگی مثبتی با افزایش بیان ژن داشته و بالعکس، نواحی متیله شده هیستون عموما به صورت نقاط فشرده کروماتین در نظر گرفته شده و از نظر بیان ژن ها غیر فعال می باشد.
به طور مشابه، متیلاسیون ریشه های سیتوزین در توالی DNA کروماتین نیز عموما سطح دومی از سرکوب بیان ژن را به دنبال دارد و الگوی بیان ژن را تعیین می کند. براساس آنچه پیشتر گفته شد، تکنیک های بررسی اپی ژنوم معمول با هدف بررسی متیلاسیون- استیلاسیون هیستون ها و نیز متیلاسیون DNA انجام می پذیرند. در این مقاله به صورت اجمالی با برخی فناوری های مرتبط با بررسی متیلاسیون DNA آشنا خواهیم شد. تکنیک های بررسی متیلاسیون DNA بر دو رویکرد کلی مبتنی هستند که شامل conversion Bisulfite و Immunoprecipitation DNA Methylated می شود. در روش conversion Bisulfite چندین پلتفرم متفاوت توانایی بررسی متیلاسیون DNA تیمار شده با بی سولفیت سدیم را فراهم می کنند. طی این فرآیند، سیتوزین های غیر متیله دچار دآمیناسیون شده و به یوراسیل تبدیل می شوند. تکنیک های پایین دست با شناسایی یوراسیل در هر نقطه از DNA تیمار شده و مقایسه با نمونه تیمار نشده پی به متیله یا غیر متیله بودن نوکلئوتید سیتوزین می برند. علاوه بر این، تکنولوژی Immunoprecipitation DNA Methylated محققین را قادر می سازد تا با بررسی گسترده تغییرات ژنومی به الگوهای متیلاسیون DNA پی ببرند. برخلاف تیمار بی سولفیتی، در این
روش از آنتی بادی های اختصاصی علیه اهداف DNA متیله استفاده می شود تا این نواحی جدا شده و برای بررسی بیشتر از طریق تکنولوژی هایی با قدرت تفکیک بالاتر همانند microarray و تکنیک های توالی یابی مورد آنالیز قرار بگیرد.
از سوی دیگر، تکنیک های بررسی برهم کنش های DNA -پروتئین مسیرهای شناسایی اصلاحات هیستونی را روشن می سازد. برهم کنش بین DNA و پروتئین ها) به ویژه هیستون ها و فاکتورهای رونویسی (اغلب به کمک تکنیکی تحت عنوان immunoprecipitation chromatin صورت می گیرد. در این روش با کمک پنلی از آنتی بادی های مختلف مجموعه های DNA و پروتئین های متصل به DNA شناسایی و اهمیت این پروتئین ها در ساختار کروماتین و بیان ژن مورد بررسی قرار می گیرد.

پروژه های مرتبط با اپی ژنوم

پروژه های بین المللی بررسی اپی ژنوم انسانی عموما با تمرکز بر متیلاسیون توالی DNA به دنبال راهی برای الگوسازی از اپی ژنوم بیماران و مخصوصا افراد سرطانی می باشند. در ادامه لیستی از پروژه های مرتبط با اپی ژنوم گنجانده شده است:

• Human Epigenome Project (HEP): http://www.epigenome.org
• Cancer Genome Project (CGP): http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP
• The Cancer Genome Atlas (TCGA): http://cancergenome.nih.gov
• NIH Roadmap Epigenomics Program: http://www.roadmapepigenomics.org
• International Cancer Genome Consortium (ICGC): http://www.icgc.org
• International Human Epigenome Consortium (IHEC): http://www.epigenomenoe.net/ihec
• Epigenome Network of Excellence: http://www.epigenome-noe.net
• Treat 1000 Project: http://www.treat1000.org

واژه اپی ژنتیک اولین بار توسط Waddington Conrad به کار گرفته شد و تا به امروز در تعریف دستخوش تغییراتی شده است. اپی ژنتیک هم اکنون به همه تغییرات غیر قابل توارث محتوای ژنوم گفته می شود که بدون تغییر در توالی بازهای آلی موجود در DNA سبب تغییر میزان بیان ژن می گردد. اهمیت این فرآیند زمانی مشخص می شود که بدانیم تمامی فرآیند های زیستی همچون تمایز سلولی، تکامل و اکولوژی موجود تحت تاثیر بیان ژن می باشد. بنابراین، اختصاصی بودن اپی ژنوم هر فرد پلی منحصر به فرد بین ژنوتیپ (توالی ژنتیکی) و فنوتیپ (شکل و عملکرد) سلول ها و ارگان های مختلف برقرار می کند. به بیان دیگر، تعامل ژنتیک و اپی ژنتیک پیغام تنظیمی اصلی برای سرنوشت یک سلول و در ابعاد بزرگتر برای یک جاندار می باشد. بر همین اساس، پایداری ژنتیک فرد به همراه انعطافی که در اپی ژنتیک وجود دارد، الگوهای متعدد و بسیار پیچیده ای از تنظیم بیان ژن در پاسخ به محرک های داخلی و خارجی فراهم می آورد. از آنجاییکه گروه متیل و استیل در کنترل بیان ژن های مختلف دارای نقش اساسی می باشند، متیلاسیون و استیلاسیون باز های آلی DNA دو مکانیسم اصلی تغییرات اپی ژنتیک در پستانداران می باشند که به طور گسترده در حوزه بیان ژن مطالعه شده اند.
در سلول ها، متیلاسیون به واسطه فعالیت سه گروه از آنزیم ها که فرآیند متیلاسیون، دمتیلاسیون و خوانش متیلاسیون را برعهده دارند صورت می پذیرد. از میان آنزیم هایی که فرایند متیلاسیون را کنترل می کنند می توان به انواع DNA متیل ترانسفرازها نظیر DNMT1 و DNMT 3b/3a) اشاره داشت که گروه متیل را از منبع آمینو اسید متیونین به نوکلئوتید سیتوزین غیر متیله بویژه در نواحی غنی از سیتوزین-گوانین (تحت عنوان جزایر CpG) منتقل می کنند. در عوض، خانواده آنزیمی family،of ten-eleven translocation (TET) methylcytosine dioxygenase (نظیر TET3 و TET-2 ،TET-1) گروه متیل را از نوکلئوتید سیتوزین متیله جدا کرده و منجر به حذف آن می شوند. براساس شواهد موجود، تمامی آنزیم های فوق جهت صحت فرآیندهای زیستی تکامل و تمایز سلولی ضروری می باشند و فعالیت نامعمول آنها در بسیاری بیماری ها گزارش شده است. افزایش متیلاسیون DNA عموما با اثرات مهاری همانند فراخواندن پروتئین های متصل شونده به متیل، مهار انواعی از فاکتور های رونویسی و تغییرات کروماتین همراه می باشد. امروزه دقت، حساسیت، سادگی و هزینه روش های بررسی متیلاسیون DNA بسیار متنوع است. بنابراین انتخاب استراتژی درست بررسی متیلاسیون ضروری می باشد.

روش های مختلف بررسی متیلاسیون DNA

ارزیابی الگوی متیلاسیون DNA در سطح نوکلئوتیدها از جمله روش های بررسی پروفایل اپی ژنتیک می باشد . تا جایی که بسیاری از بیماری های پیچیده همچون سرطان، بیماری های خود ایمن و نورودژنراتیو، همراه با تغییرات گسترده الگوی متیلاسیون DNA همراه هستند. به دلیل آنکه جهت سنجش متیلاسیون DNA از روش های رایج نظیر PCR معمولی نمی توان استفاده کرد، محققان به منظور قابل شناسایی کردن نوکلئوتیدهای متیله با استفاده از PCR ،از ترکیبات شیمیایی مختلفی استفاده کرده اند. به طوریکه، ترکیبات مورد استفاده موجب تغییر توالی نوکلئوتیدی فقط در نواحی متیله می شود. یکی از قدیمی ترین روش ها که امروزه نیز به طور گسترده در آزمایشگاه استفاده می شود، روش تیمار DNA با بی سولفیت می باشد. تیمار DNA با بی سولفیت سبب می شود که بازهای غیر متیله سیتوزین گروه آمین خود را از دست بدهند و به باز یوراسیل تبدیل شوند و پس از تکثیر به روش PCR یوراسیل ها به تیمین تبدیل می شوند. درصورتی که باز سیتوزین به صورت متیله باشد تیمار بی سولفیت اثری بر روی این باز نخواهد داشت و پس از PCR نیز به صورت سیتوزین باقی می ماند. از آنجا که همه تکنیک های بررسی متیالسیون نواحی CpG نیازمند تیمار DNA با بی سولفیت می باشند، براساس گستردگی نواحی DNA مورد بررسی، تکنولوژی های مختلف گاهی ناحیه کوچکی از ژنوم را بررسی می کنند یا شاید حتی بر کل ژنوم تمرکز داشته باشند . از همین رو روش های موجود به سه دسته با توان عملیاتی پایین ، متوسط و بالا تقسیم بندی می شوند. در ادامه تمرکز مقاله حاضر عمدتا بر تکنیک های مبتنی بر آنزیم های محدودالاثر، تیمار بی سولفیتی و نهایتا فناوری های مبتنی بر میل پیوندی خواهد بود.

1 .تکنیک های مبتنی بر آنزیم های محدودالاثر

آنزیم های محدود الاثر به گروهی از آنزیم های باکتریایی اطلاق می شود که توالی نوکلئوتیدی خاصی را شناسایی کرده و سپس باند دی سولفید را هیدرولیز می کنند. برخی از این آنزیم ها همانند HpaII و SmaI به متیلاسیون توالی های DNA به ویژه در نواحی غنی از CpG حساس می باشند. به عنوان مثال، در مورد HpaII توانایی برش سیتوزین متیله در توالی CCGG موجود در جزایر CpG گزارش شده است. برخی از آنزیم های مختلف محدودالاثر توالی یکسانی را شناسایی می کنند و از این رو ایزوشیزومر خوانده می شوند. آنزیم ایزوشیزومریک MspI علی رغم شناسایی توالی CCGG، قادر به برش توالی متیله نمی باشد. بنابراین با استفاده از ترکیبی از ایزوشیزومر ها، به راحتی میتوان الگوی متیلاسیون را در نواحی خاصی از DNA مورد بررسی قرار داد. در ابعاد بزرگتر یا اصطلاحا در مطالعات توان بالا عموما از آنزیم محدودالاثر دیگری بنام McrBC استفاده می شود که با حساسیت پایین تر نسبت به آنزیم های یاد شده تقریبا قادر به شناسایی همه نواحی متیله جزایر CpG می باشد. در نتیجه، انتخاب نوع آنزیم براساس اختصاصیت و حساسیت سبب شده روش های متنوعی از نظر گستره بررسی متیلاسیون DNA با استفاده از آنزیم های محدودالاثر ایجاد و توسعه یابد.

2 .تکنیک های مبتنی بر میل پیوندی پروتئین متصل شونده به متیل و آنتی بادی

مطالعات مختلفی حاکی از توانایی اتصال برخی پروتئین ها، به ویژه فاکتور های رونویسی، به گروه های متیل موجود در رشته DNA می باشند. چنین ویژگی در برخی از آنتی بادی ها نیز گزارش شده و به عنوان تیماری جهت افتراق سیتوزین های متیله ژنوم به کار گرفته شده اند. متدهای مبتنی بر این فناوری در ابعاد گسترده و کوچک مطالعات ژنومی استفاده شده اند و به دلیل کارایی بالا و سرعت انجام فرآیند، محققان را مجاب کرده است که جهت تشخیص متیالسیون در ادامه ی array-hybridization PCR مورد و حتی توالی یابی نسل جدید (NGS) استفاده قرار گیرند. از بارزترین معایب روش های مبتنی بر اتصال پروتئین به سیتوزین متیله آن است که پروتئین های فوق قادر به تشخیص افتراقی وضعیت متیلاسیون در جزایر CpG یا در یک نوکلئوتید CpG نمی باشند. 

3 .تکنیک های مبتنی بر تیمار DNA با بی سولفیت

برای اولین بار Frommer و همکارانش در سال ۱۹۹۲ موفق شدند طی تیمار DNA با بی سولفیت سدیم سبب دآمیناسیون و سپس متیلاسیون سیتوزین های موجود در جزایر CpG شوند. بدین ترتیب سیتوزین دآمینه شده به یوراسیل تبدیل شده و طی همانندسازی در آزمایشگاه به تیمین تغییر می یابد. در مقیاس مولکولی، افزودن سولفونات به سیتوزین موجود در نواحی CpG و غیر CpG سبب القای دآمیناسیون کربن چهارم سیتوزین شده و یوراسیل سولفونات شکل می گیرد. این درحالی ست که سیتوزین هایی که از قبل متیله بودند بدون تغییر باقی می مانند. توجه داشته باشید وقایع ذکر شده تنها بر DNA تک رشته رخ می دهد و بنابراین دناتوره کردن DNA حین تیمار با بی سولفیت سدیم ضروری می باشد. همچنین، کیفیت DNA استخراج شده، مقدار و pH واکنش یاد شده از جمله مهم ترین فاکتور های دخیل در فرآیند شیمیایی فوق می باشد و دآمیناسیون ناقص DNA از اساسی ترین معضلات این روش می باشد. این روش ساده اساس بسیاری از متدهای بررسی متیلاسیون مثل MSP ،PCR time-real pyrosequencing ،HRM ،BSP می باشد که در ادامه با توضیح بیشتری شرح داده می شوند، همچنین، این روش همراه با تکنولوژی میکرواری و توالی یابی نسل جدید جهت بررسی متیلاسیون کل محتوای ژنتیکی موجود استفاده می شود.

روش های مبتنی بر میکرواری

در سال ۱۹۹۵، واژه میکرواری در یکی از مقالات علمی به چاپ رسید و به بررسی بیان چندین ژن به صورت همزمان اشاره داشت. فناوری اری و میکرواری به عنوان یک پیشرفت در روش های بررسی بیان ژن معرفی شده است. بر همین اساس، دانشگاه استنفورد در سال ۱۹۹۷ اولین چیپ میکرواری جهت توالی یابی کل اگزوم را تهیه و روش تولید را برای همگان منتشر کرد. تا سال ها این روش تجاری سازی نشده بود تا آن که با پیشرفت پرینترهای روباتیک، امکان تولید گستره و درنتیجه توسعه چیپ های میکرواری فراهم شد. این فناوری از آنجا حائز اهمیت می باشد که هر چه تعداد بیشتری از قطعات الیگونوکلئوتیدی پروب به سطح چیپ های شیشه ای اتصال یابد، امکان آنالیز گسترده تر محتوای ژنومی فراهم می شود.

در ادامه اهداف گسترده تری برای تکنولوژی میکرواری مهیا شد و اولین تلاش های استفاده از اری برای ‏بررسی متیلاسیون و به طور کلی بررسی اپی ژنتیک قطعات ‏DNA‏ در سال ۲۰۰۲ صورت گرفت. این ‏روش تحت عنوان ‏Mehtylation specific oligonucleotide microarray‏ (‏MSO microarray‏) توسط ‏Tim ‎Hui-Ming‏ به جامعه آزمایشگاهی معرفی شد. ‏
فناوری میکرواری از جمله فناوری های در حال توسعه بررسی بیان ژن های مختلف به طور همزمان می ‏باشد. این روش به طور خلاصه شامل قرار دادن توالی هزاران قطعه ژن مختلف بر روی اسلاید های شیشه ‏ای تحت عنوان چیپ ژنی می باشد. در نتیجه با مجاور کردن نمونه ‏DNA‏ یا ‏RNA‏ مجهول با چیپ یاد ‏شده، قطعات مکمل نمونه مجهول به قطعات ژنی روی اسلاید اتصال یافته و نور از خود ساطع می کنند. ‏شناسایی نور از هر قطعه چیپ توسط آشکارسازها بدان معناست که ژن مورد نظر در نمونه اضافه شده ‏به چیپ بیان داشته است. ‏

ساختار چیپ

فناوری میکرواری و چیپ های تجاری موجود برای آن براساس هدف آزمایشگاهی مورد نظر بهینه سازی ‏شده اند. مثلا تکنولوژی ‏Bead Array‏ شرکت ‏Illumina‏ جهت بررسی متیلاسیون قطعات ‏DNA‏ تیمار ‏شده با بی سولفیت طراحی و تولید شده است. در ادامه اساس کار این فناوری توضیح داده شده و ساختار ‏چیپ مورد بررسی قرار خواهد گرفت. ‏
تکنولوژی میکرواری ایلومینا، تحت عنوان ‏Infinium methylation assay، از میکروبید های سیلیکا ‏استفاده می کند که در سطح خود حاوی صدها هزار تا میلیون ها توالی ژنوتیپی است که برای یک فرد ‏قابل بارگذاری شدن می باشد. در روند تولید این چیپ ها، بید ها ابتدا با دقت بسیار بالایی در چاهک ‏های کوچکی قرار داده شده و سپس چندین نسخه از پروب الیگونوکلئوتیدی که ناحیه خاصی از ژنوم را ‏هدف قرار می دهد، روی بید بارگذاری می شود. همزمان با عبور قطعات ‏DNA‏ نشاندار شده با رنگ های ‏فلوئورسنت از روی بیدها، هر پروب به توالی مکمل خود در نمونه ‏DNA‏ اتصال می یابد. حال به کار بردن ‏لیزر جهت برانگیختن رنگ فلوئورسنت، در صورت وجود هیبرید پروب – ‏DNA‏ نمونه مجهول، سیگنال ‏رنگی آزاد شده که براساس شدت سیگنال، میزان بیان یا متیله شدن سیتوزین موجود در ‏DNA‏ مشخص ‏می گردد. قابل توجه آنکه، در فرآیند آزمایش فوق (بررسی متیلاسیون) دو نوع بید طراحی می شود. به ‏طوری که یک بید در توالی پروب خود واجد نوکلئوتید آدنین بوده و به باز تیمین (یا به عبارتی یوراسیل ‏ایجاد شده بعد از متیلاسیون سیتوزین اتصال می باید) و توالی پروب موجود در سطح بید دیگر واجد ‏گوانین بوده و به سیتوزین غیر متیله اتصال می یابد.‏

پروتکل آزمایشگاهی

‏1.‏ تکثیر قطعه ‏DNA‏ ‏

اولین گام در پروتکل آزمایشگاهی بررسی متیلاسیون براساس فناوری ‏microarray‏ شرکت ایلومینا ‏تکثیر قطعه ‏DNA‏ نمونه مجهول می باشد. برای اینکار ابتدا کافی ست محلول مورد نیاز تکثیر را از ‏فریزر خارج کرده و بعد از ذوب شدن به نمونه های ‏DNA‏ تخلیص شده اضافه کرد. هدف از اینکار ‏تکثیر کامل ژنوم موجود در نمونه مورد بررسی می باشد تا برخلاف ‏PCR،‎ ‎محدود به مناطقG-C ‎‏ ‏نباشد. بدین ترتیب نمونه اولیه ۱۰۰۰ برابر تکثیر شده و میزان کافی از ‏DNA‏ برای میکرواری مهیا ‏می شود.‏

‏2.‏ قطعه قطعه شدن ‏DNA

همانند مرحله قبل با خارج کردن محلول ‏fragmentation‏ و ذوب کردن آن در دمای محیط، میزان ‏مورد نیاز از محلول به چاهک های ‏DNA‏ تکثیر شده اضافه می شود تا نمونه ژنومی به اندازه های ‏بهینه جهت هیبریداسیون با پروب قطعه قطعه گردد. آنزیم های اندونوکلئاز موجود در این محلول، ‏DNA‏ را به قطعات ۳۰۰ الی ۶۰۰ جفت باز خرد می کنند.‏

‏3.‏ رسوب دهی

در این مرحله، ابتدا محلول رسوب دهنده از یخچال خارج و به دمای محیط رسانده می شود. ‏همچنین، محلول مورد نیاز برای حل کردن نمونه از فریزر خارج و حداقل یک ساعت جهت ذوب ‏شدن و به دما رسیدن در محیط قرار می گیرد.‏
پیش از هیبریداسیون نمونه ‏DNA، تخلیص ژنوم به کمک ایزوپروپانول موجود در محلول ‏precipitation‏ صورت می گیرد. در نتیجه این محلول نیز به چاهک های محتوی نمونه اضافه می ‏گردد. سپس با یک مرحله سانتریفوژ کردن در دمای ۴ درجه سانتی گراد، رسوب ‏DNA‏ به دست ‏آمده و سوپ رویی به روش ‏Decant‏ کردن دور ریخته می شود.‏

‏4.‏ حل کردن نمونه

‏پس از آنکه رسوب تخلیص شده ‏DNA‏ به دست آمد، زمان حل کردن نمونه در محلول هیبریداسیون ‏می باشد. این محلول شرایط بهینه مورد نیاز برای هیبریداسیون در سطح بیدها را فراهم می کند.‏

‏5.‏ هیبریداسیون نمونه ‏DNA

در این مرحله ابتدا استریپ های محتوی ‏DNA‏ روی یک درپوش با دمای ۹۵ درجه قرار می گیرند ‏تا دو رشته قطعات ‏DNA‏ از یکدیگر باز شوند. سپس پلیت در دمای محیط به مدت ۳۰ دقیقه انکوبه ‏و تحت چرخش‏ قرار می گیرد. در ادامه نمونه ‏DNA‏ از داخل چاهک های استریپ خارج و به ‏سطح اسلاید میکرواری اضافه می شود. اختصاصیت آزمایش در این مرحله و براساس طول پروب، بافر ‏و دمای هیبریداسیون مشخص می گردد. پس از بارگذاری نمونه ها به هر چیپ، اسلاید در محفظه ‏خاص خود قرار گرفته و مجموعه به یک آون با دمای ۴۸ درجه برای مدت 18-16 ساعت‏ انتقال ‏می یابد. در همین حین، محلول های شستشو و ‏coating‏ براساس پروتکل کیت رقیق شده و در دمای ‏منفی ۲۰ نگه داری می شوند. بعد از سپری شدن زمان انکوباسیون، اسلاید از محفظه خود خارج و ‏در دمای اتاق قرار می گیرند.‏

‏6.‏ شستشوی ‏بیدچیپ ها

بیدچیپ های خارج شده از محفظه، فورا وارد محلول شستشو شده و در یک قاب پلاستیکی فیکس ‏می شوند.‏

‏7.‏ X Stain

ابتدا کافیست محلول های رنگ آمیزی از فریزر خارج شده و در محیط قرار گیرند تا ذوب شوند. وجه ‏تسمیه این مرحله به دو واژه ‏extension‏ و ‏staining‏ باز می‎ ‎گردد. منظور از ‏extension‏ افزودن یک ‏نوکلئوتید نشاندار به هر یک از پروب های موجود در سطح بیدها می باشد تا ژنوتیپ پروب موجود در ‏هر بید (از نظر هموزیگوت و هتروزیگوت بودن براساس قطعه ‏DNA‏ مکمل شده و متصل به آن) از ‏یکدیگر قابل افتراق باشند. این نوکلئوتید برای شناسایی تیمین در نمونه ‏DNA، از نوع دی دئوکسی ‏آدنوزین تری فسفات (‏ddATP‏) نشاندار شده با دی نیترو فنل و برای شناسایی سیتوزین غیر متیله از ‏نوع دی دئوکسی گوانوزین تری فسفات (‏ddGTP‏) نشاندار شده با بیوتین می باشد. در نتیجه، قطعات ‏DNA‏ موجود در نمونه مجهول اگر از هنگام اتصال به قطعه پروب، هموزیگوت باشند فقط یک نوع ‏سیگنال از خود ساطع خواهند کرد ولی از نمونه های هتروزیگوت طبیعتا دو نوع سیگنال شناسایی ‏خواهد شد. ‏
سپس با یک مرحله شستشو، قطعات ‏DNA‏ که به پروب اتصال پیدا نکرده اند از سطح چیپ شسته ‏می شوند.‏
هدف دوم از این مرحله ‏Staining‏ می باشد. بدان معنی که سیگنال فلوئورسنت اختصاصی از هر ‏پروب به سمت ‏detector‏ ها روانه شود. برای اینکار رنگ آمیزی ابتدا با ‏streptavidin‏ متصل به ‏فلوئوروکروم سبز آغاز می شود و با افزودن آنتی بادی ضد دی نیتروفنل متصل به فلوئوروکروم قرمز ‏ادامه می یابد.‏

‏8.‏ Imaging

به عنوان آخرین گام، چیپ ها در محفظه اسکنر قرار گرفته و پس از دریافت تشعشع لیزر، در هر ‏نقطه شروع به ساطع کردن نور فلوئورسنت سبز یا قرمز و یا ترکیبی از این دو می کنند. ‏Detectorها ‏با شناسایی نور، اطلاعات را به کامپیوتر انتقال و متیله یا غیر متیله بودن قطعه ‏DNA‏ متصل به هر ‏پروب سنجیده می شود.‏

آنالیز داده

Pipeline‏ در تحلیل داده های ژنومیک به مجموعه مراحل پردازش اطلاعات اشاره دارد که به صورت پی ‏در پی انجام می گیرد و نتایج خروجی یک مرحله به عنوان داده ورودی مرحله بعدی تلقی می شود.‏
پایپلاین آنالیز داده های خام حاصل از میکرواری بصورت زیر می باشد:‏

‏1.‏ کنترل کیفی نمونه

در این مرحله کیفیت نمونه ورودی به آزمایش از طریق کنترل های واجد ‏DNA‏ و کنترل فاقد نمونه ‏DNA‏ سنجیده می شود. بر همین اساس، نموداری از وضعیت بی سولفیته شدن نمونه های ‏DNA‏ و ‏کنترل های آزمایش با کمک نرم افزار ‏GenomeStudio‏ ترسیم شده (پکیج ‏HumMethQCReport‏) ‏در نرم افزار ‏R‏ نیز برای این کار قابل استفاده می باشد و با یکدیگر مقایسه می شوند.‏

‏2.‏ کنترل کیفی پروب

مشابه مرحله قبل عملکرد پروب ها از نظر توانایی اتصال به قطعات ‏DNA‏ هدف سنجیده می شود. به ‏ویژه این موضوع زمانی حائز اهمیت می گردد که نمونه های ‏DNA‏ بی سولفیت که به عنوان کنترل ‏در مرحله قبل استفاده شده اند، وضعیت مطلوبی نداشته باشند و احتمال نقص در پروب ها به دلایل ‏مختلف قوی باشد. یکی از مهم ترین مشکلاتی که در این مرحله ممکن است محققان با آن مواجه ‏باشند این است که پروب به بخش هایی از جزایر ‏CpG‏ اتصال یافته باشد که محل وقوع پلی مورفیسم ‏های تک نوکلئوتیدی (به ویژه ‏SNP‏) است. به عبارتی درصدی از میزان متیلاسیون یک بخش از ‏DNA‏ ژنومی ممکن است تحت تاثیر ژنوتیپ فرد باشد و محقق تصمیم به حذف لوکوس های مرتبط ‏با پلی مورفیسم داشته باشد. علی رغم آنکه ‏SNP‏ ها به ندرت میزان متیلاسیون را به شدت تغییر می ‏دهند، جهش های سوماتیک که به طور مثال در سلول های سرطانی رخ می دهد، تاثیر چشمگیری ‏در میزان متیلاسیون ‏DNA‏ مورد بررسی دارند.

‏3.‏ تصحیح پس زمینه

این فرآیند شامل حذف سیگنال های غیر اختصاصی ساطع شده از پلتفرم چیپ می باشد تا از ‏دخالت آن در نتایج حاصله جلوگیری شود.

‏4.‏ نرمال سازی

در این مرحله نیز منابع تجربی نویز های تصادفی که به دلایل تکنیکال یا سیستمیک در فناوری ‏میکرواری هر چیپ وجود داشته باشد حذف می شوند تا از ایجاد نتایج منفی کاذب جلوگیری شود. ‏بنابراین، برای نرمال سازی دو رویکرد اتخاذ می گردد:‏
i‏.‏ Between-array normalization‏: جهت حذف نویز های تکنیکال بین نمونه های بارگذاری شده ‏روی اری های مختلف
ii‏.‏ Within-array normalization‏: جهت تصحیح شدت بایاس ایجاد شده در هر گروه مورد مطالعه به ‏وسیله رنگ های مورد استفاده ‏
توجه داشته باشید که بسیاری از روش های نرمالیزه کردن که برای میکرواری با هدف بررسی بیان ‏ژن به کار می رود، در میکرواری با هدف بررسی میزان متیلاسیون کاربردی ندارد. از طرفی ‏متیلاسیون به طور یکسان در همه بخش های ‏DNA‏ رخ نمی دهد و جزایر ‏CpG‏ از این نظر غنی تر ‏هستند. بنابراین همواره نمودار های توزیع متیلاسیون از یک چولگی‏ برخوردارند. درنتیجه در ‏مرحله نرمالیزاسیون تا حد امکان سعی می شود انحراف طبیعی که در توزیع متیلاسیون وجود دارد، ‏عاری از نویز ناخواسته باشد.‏

‏5.‏ همگام سازی پروب نوع یک و دو

از موضوعات مهم دیگر در چیپ های میکرواری شرکت ایلومینا که برای بررسی وضعیت متیلاسیون ‏طراحی شده اند، آن است که پروب طراحی شده در سطح یک بید توانایی شناسایی سیتوزین متیله و ‏غیر متیله ۷۲ درصد از لوکوس های ژنی را دارا می باشد. بنابراین، مابقی لوکوس ها با دو نوع بید ‏مورد بررسی قرار می گیرند به طوریکه یک بید توانایی شناسایی قطعه ‏DNA‏ واجد سیتوزین متیله و ‏بید دیگر به شناسایی سیتوزین غیر متیله می پردازد. در نتیجه عمده توالی های ‏CpG‏ به پروب نوع ‏یک و مابقی به پروب های نوع دو متصل می شوند. اینکار سبب می شود توالی های بیشتری از پروب ‏در هر چیپ بارگذاری شوند در حالی که اندازه چیپ افزایش نمی یابد. اما از معضلاتی که ایجاد می ‏شود همپوشانی بخشی از سیگنال های ساطع شده از پروب نوع یک و دو می باشد که در این مرحله ‏به صورت نرم افزاری اصلاح و تصحیح می گردد.‏

‏6.‏ Adjusting batch/plate/chip confounders‏ ‏

اری های بررسی متیلاسیون ‏DNA‏ تا حد زیادی به نحوه آماده سازی هر ‏Batch‏ از یک نمونه حساس ‏می باشد. این موارد مستقل از فاکتور های بیولوژیک نمونه بوده و عموما به شرایط و زمان آزمایش و ‏آزمایشگاه بستگی دارد. بنابراین داپلیکیت های هر ‏batch‏ در این مرحله مورد بررسی قرار می ‏گیرند. حتی بعضا علی رغم طراحی قابل قبول مطالعه، عواملی مداخله گر سبب اختلال در نتایج ‏بدست امده می شود. برای مثال، حدی از‏error ‎‏ برای خطای چیپ های ساخته شده در نظر گرفته ‏می شود که با نرمالیزه کردن نتایج قابل برطرف شدن نمی باشد. این موارد می تواند ناشی از ‏emission‏ بیش از حد و گاها بدلایل ناشناخته باشد. ‏

‏7.‏ آنالیزهای پایین دست

در این بخش دیتای خام بدست امده از میکرواری بوسیله نرم افزار های بیوانفورماتیک برای دستیابی ‏به هدف مورد نظر (میزان متیلاسیون لکوس های ژنی و غیر ژنی) مورد بررسی قرار میگیرد.‏
i‏.‏ وضعیت متیلاسیون
میزان یا درصد متیلاسیون در هر لوکوس قطعه ‏DNA‏ که وارد آزمایش شده براساس یک فرمول ‏ریاضی محاسبه می شود
ii‏.‏ Differential methylation/region-based analysis‏:
این آنالیز به بررسی ارتباط میان یک فنوتیپ دلخواه و متیلاسیون یک ناحیه ‏CpG‏ خاص می ‏پردازد تا مناطقی که اصطلاحا به طور متفاوتی (مثلا در نمونه های بیمار و کنترل) متیله شده اند ‏را مشخص کند.‏
iii‏.‏ Clustering/profile analysis‏:‏
Clustering‏ یا طبقه بندی به گروه بندی کردن نتایج میکرواری باز می گردد. به طوری که، اجزای هر ‏گروه بیشترین شباهت را از نظر متیلاسیون با یکدیگر داشته و با سایر گروه ها تا حد امکان بیشترین ‏اختلاف را دارند. این موضوع به ویژه در بررسی متیلاسیون بافت های سرطانی اهمیت می باید.‏
iv‏. آنالیز مسیر
بسیاری محققان از این آنالیز برای یافتن اهمیت نتیجه به دست آمده از متیلاسیون یک یا چند ژن ‏در عملکرد خود ژن یا در مسیر های انتقال پیام استفاده می کنند.‏

8.‏ Multiple testing correction

زمانی که آنالیز های فوق به نتایجی معتبری رسید، مرحله ای تحت عنوان ‏multiple testing ‎correction‏ جهت کاهش احتمال وجود لوکوس هایی با نتایج مثبت کاذب انجام می گیرد. در واقع، با ‏بکارگیری تست های آماری همچون ‏Bonferroni correction‏ میزان خطای مثبت کاذب از دیتای در ‏دسترس کسر میگردد. این تست آماری با ایجاد داده های تصادفی مشابه دیتای به دست آمده، سپس ‏آنالیز فوق را بارها تکرار می کند تا خطای آماری نتایج را سنجیده و موارد مثبت کاذب را گزارش ‏کند.‏

9.‏ Validation of significant hits

گام نهایی در پردازش اطلاعات میکرواری با هدف بررسی متیلاسیون ‏DNA‏ تایید نتایج به دست ‏آمده، از طریق استفاده از چیپ های متفاوت و یا حتی روشی به جز میکرواری، می باشد. به ویژه در ‏این میان پایروسکوئنسینگ به عنوان ‏gold standard‏ توصیه شده است.‏

پایگاه داده ها و ذخیره سازی داده

انبوهی از اطلاعات متیلاسیون سلول ها و بافت های مشتق از افراد سالم و بیمار جمع آوری و برای ‏دسترسی ساده تر محققان در پایگاه های داده ذخیره می گردد. از جمله این موارد می توان به ‏The ‎Cancer Genome Atlas project‏ (‏TCGA‏)، ‏Gene Expression Omnibus‏ ‏‎(GEO)‎، ‏iMETHYL، ‏MethBank، ‏DiseaseMeth، ‏MethyCancer، ‏MethDB، ‏NGSmethDB، ‏PubMeth، و ‏MENT‏ اشاره ‏داشت. ‏iMETHYL‏ دیتابیسی برای ژنومیکس، پروتئومیکس و سایر ‏omics‏ ها می باشد که حاوی داده ‏های حاصل از متیلاسیون ‏DNA‏ کل ژنوم به ویژه در مورد سلول های ایمنی می باشد. ‏MethBank‏ بر ‏متیلاسیون ‏DNA‏ گونه های مختلف تمرکز داشته و به صورت دوره ای به روز رسانی می گردد. ‏DiseaseMeth‏ محتوی مجموعه دیتای متیلاسیون ۸۸ بیماری انسانی ست که مطالعات آنها گاهی بر ‏ناحیه خاصی از ‏DNA‏ تمرکز داشته و گاهی به صورت توالی یابی کل ژنوم صورت گرفته است. ‏MethyCancer‏ محتوی دیتای ژنتیکی و ژنومیک مربوط به متیلاسیون سلول های سرطانی می باشد و ‏مجموعه دیتاهای موجود در آن از طریق ‏Cancer Epigenome Project‏ کشور چین استخراج شده است. ‏MethDB‏ از جمله جالب ترین پایگاه داده های مرتبط با متیلاسیون ‏DNA‏ می باشد که طی پاسخ سلول ‏به تغییرات محیط اطراف به دست آمده است. اطلاعات حاصل از متیلاسیون متفاوت سیتوزین در یک ‏ناحیه خاص در شامپانزه و موش به صورت تجمیعی و یکپارچه در دیتابیس ‏NGSMethDB‏ گردآوری ‏شده است. ‏PubMeth‏ نیز حاوی اطلاعات متیلاسیون به دست آمده از مقالات علمی منتظر شده می ‏باشد. ‏MENT‏ نیز از ابتدایی ترین پایگاه های داده برای بررسی متیلاسیون و بیان ژن های مختلف در ‏بافت های توموری می باشد. جالب آنکه، دیتابیس ‏MethHC‏ از گسترده ترین پایگاه های حال حاضر می ‏باشد که بیش از ۵۰ هزار داده میکرواری و توالی یابی را از ‏TCGA‏ و ‏GEO‏ استخراج و به صورت ‏یکپارچه در دسترس قرار داده است. در این دیتابیس همچنین شواهد علمی متیلاسیون بیش از ۷ هزار ‏مقاله علمی استخراج و در محیطی ساده به صورت قابل نمایش در آمده است.‏

کاربردهای روش

همانطور که گفته شد بررسی متیلاسیون ‏DNA‏ به روش میکرواری محققان را قادر می سازد تا با درک ‏وقایع اپی ژنتیک که به کنترل ژن های کلیدی فرآیند های زیستی می پردازند، امکان ‏کنترل مسیرهای انتقال پیام، تکثیر و تمایز سلول را داشته باشند. بدین ترتیب علاوه بر آن که اثر اپی ‏ژنتیک در بروز بسیاری بیماری های مشخص می شود، شاید راهکار درمانی قابل استفاده ای نیز برای ‏بیماران قابل دستیابی باشد. همچنین، اگر الگوی قابل اطمینانی از تغییرات اپی ژنتیک ترسیم شود، ‏حساسیت اپی ژنتیکی افراد برای ابتلا بسیاری بیماری ها قابل توضیح و پیش بینی خواهد بود.‏

روش های مبتنی بر سکوئنسینگ کل ژنوم

تاریخچه

پروسه اولین استخراج ‏DNA‏ توسط ‏Friedrich Mietscher‏ در سال ۱۸۶۹ تا کشف روش های توسعه ‏توالی یابی ژنوم نتیجه تلاش های بی وقفه جوامع مختلف علمی در جهان می باشد. پس از آنکه ‏Watson، ‏Crick‏ وFranklin ‎‏ موفق به کشف ساختار ‏DNA‏ در ۱۹۶۵ شدند، تلاش ها برای توالی یابیDNA ‎‏ آغاز ‏شد. در سال ۱۹۷۲، ‏Walter Fiers‏ موفق شد اولین توالی یابی تاریخ را به خود ثبت کند. به طور خلاصه ‏در این روش، ریبونوکلئاز ‏T1‎‏ جهت هیدرولیز محل های خاصی از رونوشت یکی از ژن های کد کننده ‏پوشش پروتئینی باکتریوفاژ ‏MS2‎‏ مورد استفاده قرار گرفت و قطعات الیگونوکلئوتیدی با روش الکتروفورز و ‏کروماتوگرافی جداسازی شد. با توجه به دسترسی به توالی آمینواسیدی پروتئین یاد شده نهایتا توالی ژن ‏مذکور مشخص و ثبت گردید. اما جهش اصلی در دنیای توالی یابی ژنوم به نام ‏Fredrick Sanger‏ در سال ‏‏۱۹۷۷ ثبت شده است. روش او مبتنی بر توالی یابی قطعات کوچک درحال پلیمریزه شدن ‏DNA‏ می ‏باشد و تحت عنوان روش اختتام زنجیره ‏خوانده می شود. در این فرآیند، عمده نوکلئوتیدهای مورد ‏استفاده جهت تکثیر ‏DNA‏ الگو از نوع دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات (‏dNTPها) می باشد ولی بخشی از ‏نوکلئوتیدها قادر به تشکیل باند فسفو دی استر با نوکلئوتید بعدی نبوده (‏ddNTPها) و سبب خاتمه ‏فرایند پلیمریزاسیون می شوند. بعدها این روش توسعه یافت و جهت تسهیل کار از نوکلئوتیدهای ‏فلوئورسنت و رادیواکتیو استفاده شد. بدین ترتیب قطعاتی از ‏DNA‏ با طول متفاوت تشکیل می شود که ‏پس از الکتروفورز براساس نوع نوکلئوتیدی که در فرآیند سنتز ‏DNA‏ استفاده شده (دئوکسی آدنین، ‏گوانین، سیتوزین، تیمیدین یا انواع دی دئوکسی آن ها) به راحتی می توان به توالی دقیق رشته ‏الگو پی برد.‏
‏ همزمان، ‏Maxam‏ و ‏Gilbert‏ پایه گذار روش نوینی از توالی یابی ژنوم شدند که اساس آن بر مبنای ‏تغییرات شیمیایی توالی ‏DNA‏ می باشد و نیازی به پلیمریزاسیون الگو به کمک آنزیم ‏DNA ‎polymerase‏ نمی باشد. در این روش که با عنوان توالی یابی شیمیایی نیز خوانده می شود، ‏DNA‏ ‏نشاندار شده با‏ ‎32P‏ رادیواکتیو در مواجهه با مواد شیمیایی خاصی (مثل هیدرازین، دی متیلی سولفات و ‏‏…) در محل آخرین نوکلئوتید دچار شکست شده و سپس همانند روش توالی یابی سنگر مورد الکتروفورز ‏و آنالیز قرار می گیرد. این دو موفقیت، هم اکنون به عنوان اولین نسل روش های توالی یابی و یکی از ‏دقیق ترین انواع آن می باشد. ولی فرایند انجام توالی یابی خودکار نبوده و وقت گیر می باشد. هم چنین ‏این دو روش تنها برای توالی یابی قطعات ‏DNA‏ با حداکثر طول ۸۰۰ الی ۱۰۰۰ نوکلئوتید مورد استفاده ‏قرار می گیرد. ‏
اولین تکنولوژی از نسل دوم روش های توالی یابی مبتنی بر ‏luminometry‏ بوده و تحت عنوان ‏pyrosequencing‏ شناخته می شود. به بیان دقیق تر، نور ساطع شده از واکنش پیروفسفات‏ حین ‏پلیمریزاسیون ‏DNA‏ به واسطه آشکارسازهایی شناسایی و ثبت می گردد. در این روش نیز توالی هایی با ‏طول حداکثر ۴۰۰ نوکلئوتید قابل توالی یابی می باشند اما سرعت کار به طور قابل توجهی بالا بوده و ‏فرآیند به صورت خودکار قابل انجام است. با پیشرفت تکنولوژی، فناوری های توالی یابی جدید ظهور کرده ‏و پلتفرم قدرتمندی برای تعیین توالی اگزوم‏ فراهم کرد. انقلاب این ابزار ها زمانی رخ داد که دستگاه ‏های مبتنی بر این تکنولوژی امکان توالی یابی همزمان کل ژنوم را به طور همزمان برای چندین نمونه ‏داشتند به طوری که حداقل میزان خطا در خوانش توالی صورت بگیرد. این سیستم ها عمدتا توسط ‏شرکت هایی همچون ‏Illumina، ‏Ion torrent‏ وoxford nanaopore‏ توسعه یافت و هم اکنون به عنوان ‏ابزار اصلی برای تایید وقایع مبتنی بر تغییرات توالی (تغییرات ژنتیک) و اپی ژنتیک مورد استفاده قرار می ‏گیرد. در بخش های دیگر با توضیحات جامع تر، فرآیند استفاده از این تکنولوژی در بررسی متیلاسیون ‏DNA‏ شرح داده خواهد شد. ‏

تکنیک های مبتنی بر تیمار بی سولفیت

تا مدت ها بررسی متیلاسیون ها از طریق اندونوکلئازهای اختصاصی متیلاسیون انجام می گرفت. ‏اساس این روش ها بر پایه ناتوانی آنزیم ‌های محدودکننده‌ی حساس به متیلاسیون در برش سیتوزین‌های ‏متیله شده موجود در جایگاه تشخیص می‌باشند. مشکل اساسی که در رابطه با اندونوکلئازهای اختصاصی ‏متیلاسیون وجود دارد این است که تنها سیتوزین ‌هایی می ‌توانند مورد بررسی قرار بگیرند که بتوانند ‏توسط اندونوکلئازهای اختصاصی متیلاسیون موجود، تشخیص داده شوند به عنوان مثال،HpaII (CCGG) ‎‏ وHhaI (GCGC) ‎‏. به علاوه، استفاده از این متدها مناسب آنالیزهای متیلاسیونی که روی کل ژنوم انجام ‏می‌گیرد و نیز تکنیک ‌های کشف نشانگرها ‎است، اما در بررسی وضعیت متیلاسیون جایگاه‌های‎ CpG ‎اختصاصی چندان مفید عمل نمی‌کند. هم چنین، این تکنیک ‌ها علی‌رغم سادگی، سرعت و حساسیت ‏بالا، نسبت به روش های سکوئنسینگ حاضرنیازمند مقادیر بالایی از‎ DNA ‎با کیفیت هستند.‏
امروزه بسیاری از روش های موجود برای مطالعه تغییرات وضعیت متیلاسیون پروموترهای حاوی جزیره‎ ‎CpG ‎وابسته به ایجاد تغییر در‎ DNA ‎تحت تاثیر نمک سدیم بی‌سولفیت‏ می باشند. سپس تکثیر توسط‎ ‎PCR ‎انجام می‌گیرد و امکان تمایز آلل‌های متیله شده و متیله نشده از یکدیگر فراهم می‌گردد‎.‎‏ استفاده از ‏سدیم بی سولفیت منجر به فیکس شدن الگوی متیلاسیون و برطرف کردن محدودیت های روش آنزیم ‏محدود کننده می شود. تیمار‎ DNA ‎با بی سولفیت‎ ‎سبب می‌شود که بازهای غیر متیله سیتوزین گروه ‏آمین خود را از دست بدهد و به باز یوراسیل تبدیل شود که همانند باز تیمین مکمل باز آدنین می‌باشد. ‏بنابراین، باز سیتوزین بدون متیله به باز‎ T ‎تبدیل خواهد شد.‏‎ ‎اما در صورتی‌که باز سیتوزین به‌ صورت ‏متیله باشد تیمار بی‌سولفیت اثری بر روی این باز نخواهد داشت. بنابراین به ‌وسیله تیمار‎ DNA ‎به ‌وسیله ‏بی سولفیت و بررسی تبدیل باز ‏C‏ به باز‎ T ‎‏می‌توان به متیله بودن و یا غیر متیله بودن بازهای‎ C ‎پی برد‎.‎‏ ‏پس از تیمار رشته‌های‎ DNA ‎با بی سولفیت، تغییر بازهای ‏C‏ به ‏‎ Tبا روش‎ PCR ‎بررسی می‌ شوند. اساس ‏روش های ذکر شده، اصلاح شیمیایی سیتوزین در ‏DNA‏ تک رشته ای است. بنابراین مرحله دناتوراسیون ‏DNA‏ طی تیمار با بی سولفیت حائز اهمیت است. وجود یکی از رشته های ‏DNA‏ در ارزیابی های ‏بیوانفورماتیکی برای عملکرد تکنیک های پایین دست مانند تکثیر، تعیین توالی و میکرواری لازم است. به ‏طور کلی، کیفیت (نحوه استخراج) و کمیت ‏‎(< 2µg)‎‏ ‏DNA‏ تخلیص شده و ‏PH‏ واکنش برای استفاده از ‏محلول بی سولفیت از عوامل حیاتی به شمار می روند. درمان ناقص بی سولفیت مشکل اصلی در روش ‏های مبتنی بر بی سولفیت است که ‏Zymo‏ و همکارانش برای رفع این مسئله یک کیت تحقیقاتی تجاری ‏بی سولفیت ارائه کرده اند. ‏
به طور کلی روش های بررسی متیلاسیون ‏DNA‏ در سه بخش اصلی شامل

1) آماده سازی

‏2 ‏تیمار DNA با بی سولفیت، 

3) شناسایی مناطق متیله شده (‏PCR، تعیین توالی یا هضم آنزیمی)

طبقه بندی ‏شده است. چندین عامل مهم متدولوژیکی در این تکنیک از قبیل مقیاس مطالعه (توان بالا، ‏متوسط یا کم)، مقدار ‏DNA‏ آغازین، هزینه و زمان، حساسیت و دقت آزمایش و روش های کیفی یا کمّی ‏وجود دارند. از این رو، چالش های رایج و نکات فنّی برای هر یک از روش ها مانند ‏PCR، توالی یابی و ‏واکنش های هضم آنزیمی وجود دارند که باید به منظور بهینه سازی واکنش های اختصاصی ‏PCR، ‏اجتناب از هضم آنزیمی ناقص یا غیر اختصاصی، مقرون به صرفه بودن و عیب یابی کلونینگ و توالی یابی ‏مورد توجه قرار گیرند. ملاحظات دقیق برای بهینه سازی وضعیت دناتوره شدن ‏DNA، تیمار بی سولفیت، ‏شرایط انکوباسیون و ارزیابی ‏DNA‏ اصلاح شده پس از تیمار با بی سولفیت بسیار مهم است. پس از آماده ‏سازی ‏DNA، تیمار با بی سولفیت گام بعدی است. مطالعات کشت سلولی، آماده سازی های بیوپسی و ‏مایعات بدن نیازمند جداسازی سلول ها و استخراج و تخلیص ‏DNA‏ می باشد.‏

‏متداول ترین روش هایی که برای بررسی متیلاسیون بر اساس تکنیک‎ PCR ‎استفاده می شوند عبارتند ‏از: ‏
‏(1) تکنیک ‏PCR‏ توالی یابی بی سولفیت ‎ ‎
‏(2) تکنیک ‏‎ PCRاختصاصی متیلاسیون
‏(3) تکنیک ریل تایم ‏PCR‏ حساس به متیلاسیون ‏
‏(4) تکنیک آنالیز منحنی ذوب با قدرت تفکیک بالا ‏ ‏
‏(5) تکنیک پایروسکوئنسینگ ‏DNA‏ بی سولفیته ‏ ‏
‏(6) تکنیک آنالیز تلفیقی روش برش و روش بی سولفیت ‏ ‏
(7) تکنیک ‏Reduced-representation bisulfite sequencing ‎

‏ (1) تکنیک توالی یابی بی سولفیت

‏ این روش که توسط ‏Frommer‏ و همکارانش در سال 1992 توصیف شد، یک منطقه خاص را توالی یابی ‏می کند تا اطلاعات کمّی در مورد محتوای ‏C‏ یا ‏T‏ در یک ‏CpG‏ خاص به دست آورد. این روش کلاسیک ‏شامل مراحل تیمار با بی سولفیت، تقویت ‏PCR‏ و توالی یابی است. در روش‎ BSPابتدا‎ DNA ‎استخراج شده ‏از نمونه ‌ها به ‌وسیله بی سولفیت تیمار می‌گردد و سپس برای دو طرف جزیره‎ CpG ‎پرایمر طراحی شده و ‏سپس قطعه تکثیر شده تعیین توالی می‌گردد‎.‎‏ محصول یا به صورت مستقیم یا پس از کلون کردن آن در ‏یک وکتور مناسب به وسیله توالی یابی سنگر توالی یابی می شود. دستور العمل های طراحی پرایمر ‏BSP‏ ‏در ابتدا در سال 1994 توسط ‏Clark‏ و همکارانش منتشر شد. در این روش پرایمرها فاقد دی ‏نوکلئوتیدهای ‏CpG‏ است. توالی پرایمر فوروارد ‏بخشی از توالی قطعه مورد بررسی می ‌باشد و با آن هم ‏جهت است، اما توالی پرایمر معکوس‎ به ‌صورت ‏reverse-complement‏ با توالی قطعه مورد نظر می ‌باشد. ‏تمامی این مراحل می ‌توانند به کمک نرم ‌افزارهایی مانند‎ METHYL PRIMER EXPRESS ‎به انجام ‏برسند‎.‎‏ با مقایسه توالی به دست آمده با توالی مرجع می توان وضعیت متیلاسیون در ناحیه ‏CpG‏ را ‏تفسیر کرد. وجود یک پیک ‏C‏ نشان دهنده وجود 5-متیل سیتوزین‏ (‏‎5mC‎‏) در ژنوم است. تشخیص ‏ژنومی ‏‎5mC‎‏ به وسیله روش ‏BSP‏ به عنوان روش استاندارد طلایی برای تشخیص متیلاسیون ‏DNA‏ در ‏نظر گرفته می شود.‏
مزایای روش: ‏
‏1)‏ تشخیص همزمان متیلاسیون در چندین سایت ‏CpG
‏2)‏ آنالیز کمّی متیلاسیون در امپلیکون
‏3)‏ نیاز به یک جفت پرایمر
معایب روش: ‏
‏1)‏ عدم وجود اطلاعات در سطح تک مولکول
‏2)‏ وجود نویزهای قابل توجه در نتایج توالی
آنالیز داده: ‏
کمّی سازی سطح متیلاسیون با مقایسه نسبی ارتفاع پیک های سیتوزین و تیمین در هر سایت ‏CpG‏ ‏تعیین می شود. پیک تیمین به عنوان یک ‏CpG‏ غیر متیله تفسیر می شود و پیک سیتوزین یک ‏CpG‏ ‏متیله شده را نشان می دهد. تحلیل داده های خام حاصل از BSP اغلب دشوار است، بدین منظور از ‏الگوریتم های ‏ESME، ‏BiQ Analyzer‏ و ‏BISMA‏ برای تفسیر داده ها کمک گرفته می شود.‏
کاربرد روش:‏
این تکنیک برای تعیین پروفایل متیلاسیون کروموزوم های 6، 20 و 22 و هم چنین برای تشخیص ‏متیلاسیون ژن های ناهنجار مانند سرطان استفاده می گردد.‏

‏(2) تکنیک ‏PCR‏ اختصاصی متیلاسیون 

‏معرفی تکنیک متیلاسیون ‏DNA‏ اختصاصی توسط ‏Herman‏ و همکارانش در سال 1996 زمینه ساز ‏پیشرفت های زیادی در پژوهش های متیلاسیون ‏DNA‏ گردید. ‏MSP‏ تجزیه و تحلیل کیفی و حساس ‏هایپرمتیلاسیون پروموتر را در جزایر ‏CpG‏ در رده های سلولی و در نمونه های بالینی امکان پذیر می کند. ‏در ‏MSP، ‏DNA‏ تیمار شده با بی سولفیت با استفاده از مجموعه پرایمرهای اختصاصی تکثیر می یابد و ‏نیازی به آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون نمی باشد.‏‎ MSP ‎یک روش سریع است که برای ‏تعیین پروفایل همزمان چندین نمونه استفاده می شود.‏
روش‎ MSP ‎نیازمند دو جفت پرایمر می ‌باشد، یک جفت پرایمر فوروارد و معکوس اختصاصی برای‎ DNA ‎تیمار شده با بی سولفیت در حالت سیتوزین های متیله شده ‎‎و یک جفت پرایمر فوروارد و معکوس ‏اختصاصی برای‎ DNA ‎تیمار شده با بی سولفیت از نوع غیرمتیله‎. بنابراین برای هر نمونه دو واکنش‎ ‎PCR ‎با هر جفت پرایمر انجام می ‌شود و متیلاسیون نسبی بر اساس تفاوت مقادیر ‏Ct‏ آن ها محاسبه می ‏گردد. تفسیر نتایج ‏MSP‏ آسان است؛ تکثیر با جفت پرایمرهای‎ ‎متیله،‎ ‎متیلاسیون جایگاه ‌های‎ CpG ‎را ‏نشان می‌ دهد و تکثیر با جفت پرایمرهای‎ ‎غیر متیله، بیانگر عدم متیلاسیون در جایگاه ‌های پرایمر ‏می‌باشد. یک احتمال دیگر هم وجود دارد و آن هم این است که توالی توسط هر دو جفت پرایمر متیله‎ ‎و‎ ‎غیر متیله تکثیر شود که این بیانگر متیلاسیون جزئی این توالی می‌ باشد. پرایمرهای روش ‏MSP‏ باید ‏طولانی باشند (معمولاً بین 20 تا 30 باز) و اندازه آمپلیكون باید كوتاه باشد (بین 100 تا 300 جفت ‏باز). بر اساس چندین گزارش، مناطق غنی از ‏CG‏ طول محصولات ‏PCR‏ را محدود می کند، بنابراین؛ ‏طول بهینه باید حداکثر تا 400 ‏bp‏ باشد. هم چنین لازم است پرایمرها برای داشتن اختصاصیت بالا ‏حداقل یک یا دو ‏CpG‏ در انتهای ‏‎3’‎‏ داشته باشند. در نهایت، وضعیت متیلاسیون ‏DNA‏ هدف به وسیله ‏تصویربرداری ژل الکتروفورز مشخص می شود. قابل ذکر است که این روش تنها سیتوزین های واقع در ‏محدوده پرایمر متیلاسیون را ارزیابی می کند. علاوه بر این، ناهمگونی متیلاسیون یک موضوع دیگر در ‏تکثیر است که به فقدان الگوی ‏DNA‏ یکسان یا ناهمگونی متیلاسیون در ‏DNA‏ سلول ها اشاره دارد. یک ‏نگرانی دیگر، وجود دو رشته ‏DNA‏ غیر مکمل پس از انکوباسیون بی سولفیت در واکنش ‏PCR‏ است که ‏یکی از آنها به عنوان الگو است. پرایمرها نباید در این روش به رشته ‏DNA‏ نامطلوب متصل شوند. به نظر ‏می رسد که در ابتدا پرایمر معکوس متصل شده و تکثیر می یابد، و سپس پرایمر فوروارد طبق جهت ‏‎5′-‎‎3’‎‏ تکثیر می شود.‏
آنالیز داده:‏
MSP‏ در مقایسه با ‏BSP‏ یک رویکرد کیفی است. در نتیجه، برای تجزیه و تحلیل نیمه کمّی، می توان از ‏نرم افزار ‏ImageJ‏ برای محاسبه شدت باند و مقایسه شدت ها با شدت استاندارد برای به دست آوردن ‏درصد نسبی متیلاسیون استفاده کرد. با این حال، ساده ترین راه برای تعیین کمّیت ‏MSP‏ استفاده از ‏PCR‏ کمّی خاص متیلاسیون در زمان واقعی‏ ‏ (‏qMSP‏) است. با استفاده از این روش، سطح نسبی ‏متیلاسیون ژن مورد نظر در نمونه به صورت درصد محاسبه می شود. درصد متیلاسیون هر ژن برابر است ‏با نسبت مقدار متوسط ‏DNA‏ ژن متیله شده به مقدار متوسط ‏DNA‏ ژن مرجع داخلی که در 100 ضرب ‏می شود. از آن جا که طراحی پرایمر حائز اهمیت بالایی است، نرم افزارهای اختصاصی به این منظور ‏طراحی شده است. برنامه طراحی پرایمرهای اختصاصی متیلاسیون را می توان در سایت urogene‏ یافت. وجود تنها یک باند خاص از واکنش با پرایمرهای های ‏اختصاصی متیله شده یا عدم وجود هر نوع آمپلیکون، ممکن است مورد مثبت کاذب یا منفی کاذب باشد. ‏بنابراین، برای پیشگیری از این موارد، روش ‏MSP‏ باید دارای یک کنترل مثبت برای واکنش پرایمر غیر ‏متیله شده، یک کنترل مثبت (‏‎ ‎نمونه ‏DNA‏ که در ‏in vitro‏ متیله شده) و یک کنترل منفی فاقد ‏DNA ‏برای واکنش ‏PCR‏ باشد. ‏
مزایای روش: ‏
‏1)‏ نیازمند مقادیر کمتری از ‏DNA‏ ‏
‏2)‏ تفسیر نتایج بسیار آسان ‏
‏3)‏ حساسیت بالا (قدرت تشخیص یک آلل متیله شده در ازای 100 آلل متیله نشده)‏
‏4)‏ مقرون به صرفه بودن
‏5)‏ عدم نیاز به کلونینگ و توالی یابی
محدودیت های روش: ‏
‏1)‏ این تکنیک روشی کیفی است و تنها حضور یا عدم حضور متیلاسیون در ناحیه مورد نظر را ‏تشخیص می دهد ولی قادر به آنالیز کمّی متیلاسیون در نمونه الگو نمی باشد.‏
‏2)‏ احتمال وجود نتایج مثبت کاذب یا منفی کاذب
کاربردهای بالینی: ‏
‏1)‏ بررسی میزان پاسخ بیماران سرطانی به داروهای آلکیله کننده
‏2)‏ بررسی هایپرمتیلاسیون و غیر فعال شدن ژن های سرکوب کننده تومور
‏3)‏ بررسی بیماران دارای نقص در متیلاسیون ‏DNA

‏(3) Real-time PCR حساس به متیلاسیون ‎

تکنیک ریل تایم ‏PCR‏ حساس به متیلاسیون مبتنی بر Real-time PCR و تیمار بی سولفیت که برای ‏تشخیص کیفیت و کمّیت متیلاسیون توسعه یافته است.‏Eads ‎‏ و همکارانش فناوری ‏TaqMan‏ را برای ‏تعیین وضعیت متیلاسیون ‏DNA‏ در مناطق ژنومی خاص معرفی کردند و آن را ‏MethyLight‏ نامیدند. در ‏پروسه ‏MethyLight، از دو پروب ‏FAM‏ به عنوان گزارشگر و ‏TAMRA‏ به عنوان خاموش کننده برای ‏افزایش اختصاصیت متیلاسیون ناحیه مورد نظر استفاده می شود. نسبت متعادلی از توالی های تکثیر شده ‏‏(متیله و غیر متیله) برای کسب تصاویر مناسبی از الگوهای متیلاسیون ضروری است. سطح متیلاسیون به ‏عنوان نسبت اندازه گیری های حاصل از ژن هدف و ژن مرجع تعریف شده است. دستاوردهای پیشرفته تر ‏پروب های ‏TaqMan‏ شامل تولید آمپلیکون فلوئورسنت حساس به متیلاسیون ‏(‏‎(MS-FLAG‏ و متیل ‏سنگین است. در ‏MS-FLAG، یک جفت پرایمر خاص برای اتصال به ‏CpG‏ متیله شده منطقه هدف ‏طراحی شده است. پرایمرها حاوی الیگونوکلئوتید در انتهای ‏‎5’‎‏ با یک خاموش کننده و گزارش گر هستند ‏که توسط اندونوکلئاز ‏PspGI‏ جدا شده است. در طول تکثیر، آنزیم ‏PspGI‏ نقاط تشخیصی دو رشته را ‏قطع می کند و خاموش کننده برای تولید فلورسانس رها می شود. منطقه غیر متیله فاقد محصول ‏PCR‏ ‏است. در روش متیل سنگین، مسدود کننده های الیگونوکلئوتید به ‏CpGهای غیر متیله در واکنش ‏PCR‏ ‏متصل می شوند. بنابراین، پروب ها قادر به اتصال به ‏CpGهای غیر متیله نبوده و تکثیر نمی شوند، در ‏حالی که پروب ها به ‏CpG‏ متیله متصل شده و در طول تکثیر نور فلوئورسنت آزاد می کنند. کیفیت و ‏کمیت وضعیت متیلاسیون، تمایز توالی های متیله و غیر متیله و ناهمگونی متیلاسیون از طریق منحنی ‏های ذوب و تکثیر ارزیابی می شوند. اگرچه ‏Real-time PCR‏ تشخیص متیلاسیون را تسهیل می کند اما ‏برخی از مشکلات ناشی از ناهمگونی الگو و تکثیر الگوی غیر متیله هم چنان باقی است. ‏MethyLight‏ ‏برای شناسایی مارکرهای پیش آگهی در سرطان سینه انسان و دهانه رحم استفاده شده است.‏

‏(4) تکنیک آنالیز منحنی ذوب با قدرت تفکیک بالا ‏‎(HRM)‎

HRM‏ یکی دیگر از روش های کمّی مبتنی بر تیمار بی سولفیت و ‏Real-time PCR‏ است که در آن ‏آنالیز کمّی منحنی های ذوب قطعات ‏DNA‏ پس از تکثیر ‏PCR‏ انجام می شود. این روش برای اولین بار ‏برای بررسی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی‏ ‏‎(SNP) DNA‏ معرفی شد. در روش‎ HRM ‎از رنگ ‏های فلوئورسنت مختلفی استفاده می گردد، که توانایی اتصال به‎ DNA ‎دو رشته ای را دارند و در غلظت ‏بالا سبب مهار‎ PCR ‎نمی شوند که از جمله آنها به رنگ های ‏‎SYTO 9 Green، ‏Eva Green،SYBR ‎Green‎‏ اشاره کرد. به منظور طراحی پرایمرهای اختصاصی برای توالی های بی سولفیت می توان از نرم ‏افزار ‏Gene Runner‏ استفاده کرد و پرایمر طراحی شده را در پایگاه داده BiSearch چک نمود. در بررسی وضعیت متیلاسیون، رشته‌ی متیله و غیر ‏متیله با توجه به اختلاف توالی که توسط تیمار با بی سولفیت در آنها اعمال می گردد، دمای ذوب ‏‏(منحنی ذوب) متفاوتی دارند‏‎.‎‏ ‏DNA‏ ای که در ابتدا متیله شده بود، سیتوزین ها را حفظ می کند و دمای ‏ذوب بالاتری نسبت به دمای غیر متیله شده دارد. در این روش برای کنترل وضعیت متیلاسیون منطقه ‏مورد نظر‎ DNA، کنترل تجاری متیله و غیر متیله وجود دارد. منحنی متیلاسیون نمونه ها در مقایسه با ‏کنترل ‏DNA‏ ارزیابی می شود و به صورت درصد متیلاسیون محاسبه می شود. سوگیری در انتخاب ناحیه ‏متیله و غیر متیله به عنوان الگو یک مشکل دیگری است که تغییرات جزئی در طراحی پرایمر آن را بهینه ‏می کند. اشکال این روش ضرورت دست یابی به یک محصول ‏PCR‏ خالص است که در بسیاری از موارد ‏مشکل است. با این وجود، اگر یک محصول ‏PCR‏ خالص به دست آید، حتی تفاوت های کوچک (5 تا ‏‏10%) در متیلاسیون ‏DNA‏ قابل تشخیص است. جذابیت استفاده از تکنیک‎ HRM ‎در سهولت، دقت و ‏سرعت عمل آن نسبت به دیگر روش های تحلیل وضعیت متیلاسیون‎ DNA ‎ است.‏
آنالیز داده:‏
میزان شدت متیلاسیون از روش مقايسه ای به کمک فرمول ‎ 2–∆∆Ct‎‏ به محاسبه می شود. برای ارزیابی ‏کمّی درصد متیلاسیون، چنانچه درصد ژن مورد نظر از کنترل بالاتر باشد، به عنوان نمونه متیله شده در ‏نظر گرفته می شود. ‏

‏(5) تکنیک پایروسکوئنسینگ ‏DNA‏ بی سولفیته

دکتر رونقی و همکارانش در سال 1998 طراحان پیشگام در تعیین پایروسکوئنسینگ بودند. این تکنیک ‏در ابتدا به منظور بررسی ‏SNPها مورد استفاده قرار گرفت. به منظور استفاده در توالی ‌یابی، واکنش‌های‎ ‎پایروسکوئنسینگ به صورت پی‌درپی‎ ‎انجام می‌گیرند تا توالی‎ DNA ‎را در حین سنتز آن ثبت نمایند. ‏DNA‏ با استفاده از ‏PCR‏ تکثیر یافته و با پرایمر بیوتینیله شده نشاندار می گردد. تفاوت اصلی این روش ‏با روش‌های موجود استفاده از ‏dNTP های دارای برچسب رادیواکتیو یا فلوئورسنت است. این روش بر ‏اساس تشخیص نورسنجی از انتشار پیروفسفات (دو گروه فسفات به هم پیوسته) به دنبال اضافه شدن ‏نوکلئوتیدها به زنجیره ‏DNA‏ در طول همانندسازی به دست می آید. این روش شامل فرآیندی دو آنزیمی ‏است: در واکنش اول پیروفسفات به وسیله آنزیم ‏ATP‏ سولفوریلاز، به ‏ATP‏ تبدیل می‌شود و سپس ‏ATP‏ ‏تولید شده به عنوان سوبسترا برای آنزیم لوسیفراز مصرف شده و لوسیفراز تولید نور متناسب با مقدار ‏پیروفسفات می‌کند. نور ساطع شده توسط دوربین های متصل به صفحه سیلیکونی ثبت و به صورت پیک ‏در یک گراف نمایان می شود. تبدیل بازهای ‏C‏ به ‏T‏ در ‏DNA‏ بی سولفیته می تواند به صورت کمّی ‏سنجیده شود. در پایروسکوئنسینگ نسخه های متعددی از ‏DNA‏ در یک واکنش تکثیر می شود و ارزیابی ‏متیلاسیون را تسهیل می کند. این تکنیک قادر است تفاوت های کوچک در متیلاسیون حتی تا 5 درصد ‏را تشخیص دهد و یک رویکرد خوب برای نمونه های ناهمگون (به عنوان مثال سرطان) است، جایی که ‏فقط بخشی از سلول ها دارای ژن متیله متفاوتی هستند. طول توالی خوانده شده در این روش در سال ‏‏2005 برابر ‏bp‏ 100-150 بود اما در سال 2009 شرکت ‏Roche‏ با انجام تغییراتی توانست طول توالی ‏خوانده شده را به ‏bp‏ 1000 برساند.‏
مزایای روش:‏
‏1)‏ دقت، انعطاف پذیری و پردازش به صورت موازی (آنالیز 96 نمونه به صورت همزمان)‏
‏2)‏ عدم نیاز به پرایمر و نوکلئوتید نشاندار
‏3)‏ عدم نیاز به الکتروفورز که فرآیندی طولانی و زمان بر است (امکان مشاهده نتایج در همان لحظه)‏
‏4)‏ بدون نیاز به کلون کردن برای ازدیاد قطعه مورد نظر (تکثیر به کمک ‏PCR‏)‏
معایب روش: ‏
‏1)‏ کاهش دقت شناسایی توالی های هموپلیمرها به خصوص بیشتر از 5 نوکلئوتید می باشد.‏
‏2)‏ هزینه ی بالای توالی یابی با این روش در مقایسه با سایر روش های توالی یابی در مقیاس وسیع
کاربرد روش: ‏
برای ارزیابی پروفایل متیلاسیون ‏DNA‏ در مطالعات متعدد سرطان، از جمله بدخیمی های زنان و زایمان، ‏از روش پایروسکوئنسینگ استفاده شده است.‏

‏(6) آنالیز تلفیقی روش برش و روش بی سولفیت ‏

برای اولین بار در سال 1997 روش‎ COBRA ‎جهت بررسی کمّی هایپرمتیلاسیون ابداع شد. اساسا این ‏روش برای آنالیز مقادیر اندک ‏DNA‏ از نمونه های بافتی جدا شده از پارافین ایجاد شده است. از آن زمان ‏تاکنون این روش کاربرد گسترده ای در تحقیقات سرطان و مطالعات اپی ژنتیک داشته است.‏‎ ‎طراحی ‏پرایمر در این روش مشابه‎ BSP ‎می‌باشد با این تفاوت که در این روش تشخیص متیلاسیون توسط ‏آنزیم‌های محدودکننده صورت می‌پذیرد. برای دو طرف منطقه‎ CpG ‎یک جفت پرایمر طراحی می‌شود و ‏بعد از تکثیر توالی توسط پرایمرها، محصولات آن با آنزیم محدودکننده تیمار می‌شود‎.‎‏ در واقع بعد از ‏تیمار‎ DNA ‎با بی‏سولفیت و انجامPCR ‎، محصولات آن تحت برش آنزیمی قرار می‏گیرند‎.‎‏ از آنزیم هایی ‏مانند ‏‎ TaqI ,BstUIو‎ MluI ‎برای برش استفاده می شود. با توجه به ردیف بازهای اولیه‎ DNA ‎این آنزیم ‏به‏گونه‏ای انتخاب می‏شود که عمل برش را فقط در جزایر‎ CpG ‎دارای هایپرمتیلاسیون انجام دهد. میزان ‏هایپرمتیلاسیون در‎ DNA ‎اولیه با میزان کمّی برش محصولات‎ PCR ‎متناسب است. اگر‎ CpG ‎درDNA ‎‏ ‏اولیه فاقد هایپر‎‫‫‎متیلاسیون باشد در اثر تیمار بی‏سولفیت سیتوزین تبدیل به تیمین شده و جایگاه برش ‏آنزیم از بین می‏ رود و عمل برش انجام نخواهد شد. اگر در ‏DNA‏ اولیه مخلوط آلل‏های متیله و غیرمتیله ‏وجود داشته باشد در زمان هضم آنزیمی، میزان برش‏ها وابسته به مقدار ‏CpG‏ های متیله دارد. سپس ‏قطعات برش یافته توسط الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید به یک باند بزرگ هضم نشده و چندین باند ‏کوچک تر مربوط به قطعات هضم شده جدا می شوند. با غلظت سنجی باندها در ژل پلی اکریل آمید (با ‏کمک نرم ‏افزار ‏ImageJ‏) میزان کمّی هایپر‎‫‎متیلاسیون محاسبه می‏شود.‏‎‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‎‏ کمّی سازی متیلاسیون از مقایسه ‏نسبت بین محصولات ‏PCR‏ هضم شده و باقی مانده برای ارزیابی میزان سیتوزین های متیله و غیر متیله ‏در منطقه مورد نظر ‏DNA‏ انجام می گیرد.‏‎‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‎
محدودیت های روش: ‏
‏1)‏ در صورتی‌که برای توالی مورد بررسی آنزیم محدود کننده ای یافت نشود نمی‌توان از این روش ‏استفاده نمود.‏
‏2)‏ هضم ناقص توسط آنزیم های محدود کننده پس از ‏PCR، عدم وجود متیلاسیون ‏DNA‏ را نشان ‏می دهد (در صورت برش با آنزیم حساس به متیلاسیون مانند ‏HpaII‏)‏
‏3)‏ در نمونه های پیچیده، ناهمگونی نوع سلول می تواند بررسی را دچار اشتباه کند زیرا ‏DNA‏ به ‏درستی توالی یابی نمی شود. به ویژه، ناهمگونی در توالی سلول های مختلف نمونه (یعنی ‏جمعیت سلول های مختلف درون تومور) که دچار جهش هایی در منطقه مورد نظر شده اند، ‏مانند تغییر دی نوکلئوتید ‏CG‏ به ‏CA‏ یا ‏CT، منجر به از دست دادن محل محدودیت می شود و ‏باعث ایجاد یک منطقه ظاهرا متیله شده به دلیل عدم هضم می شود. در این صورت کمّی سازی ‏سطوح متیلاسیون ‏DNA‏ در یک نمونه دچار تحریف می گردد.‏
کاربرد روش: ‏
‏1)‏ غربالگری تغییرات متیلاسیون ‏DNA‏ در پروموترهای ژن در مطالعات سرطان (به عنوان مثال، ‏مطالعه متیلاسیون ‏DNA‏ در ژن ‏HPP1‎‏ در سرطان کولورکتال)‏
‏2)‏ شناسایی الگوهای تغییر یافته متیلاسیون در ژن های حک شده
‏3)‏ توصیف الگوهای متیلاسیون در ژنوم در طی تکامل در پستانداران
‏4)‏ تشخیص اختلال ژنتیکی سندرم ‏Russell-Silver‏ (هیپو متیلاسیون ژن ‏H19‎‏ در 50% بیماران)‏

‏ (7) تکنیک Reduced-representation bisulfite sequencing ‎‏ ‏

یک روش کارآمد برای تجزیه و تحلیل پروفایل متیلاسیون در سطح ژنوم در سطح نوکلئوتیدی است. با ‏توجه به هزینه زیاد و عمق تعیین توالی برای بررسی وضعیت متیلاسیون در کل ژنوم، ‏Meissner‏ و ‏همکارانش این روش را در سال 2005 برای تعیین توالی 1% ژنوم توسعه دادند. در این روش مقدار ‏نوکلئوتیدهای مورد نیاز کاهش یافته است. این محققان برای بررسی صحّت تکنیک، متیلوم سلول های ‏بنیادی جنینی موش ‏‎(ES‎ ‎)‎‏ را با سلول های ‏ES‏ فاقد ‏DNA‏ متیل ترانسفراز ‏‎(Dnmt3a, 3b)‎‏ و با سلول ‏های ‏ES‏ دارای سطوح کاهش یافته ‏Dnmt1‎‏ مقایسه کردند. آن ها از ‏BglII‏ به عنوان آنزیم محدود کننده ‏غیر حساس به متیلاسیون برای هضم ‏DNA‏ ژنومی استفاده کردند. قطعات ‏DNA‏ به طول 500-600 ‏جفت باز انتخاب و کلون شد تا توالی یابی شود. این محققان ‏DNA‏ را با استفاده از فناوری توالی یابی ‏سنگر توالی یابی کردند. با گذشت سال ها، روش ها و پروتکل های ‏RRBS‏ بهبود یافته اند. اول اینکه به ‏جای ‏BglII، آنزیم ‏MspI‏ برای پوشش بهتر سایت های ‏CpG‏ استفاده شد. ثانیا با پیشرفت در فناوری های ‏توالی یابی ‏DNA، توالی یابی سنگر با تعیین توالی نسل بعدی ‏‎(NGS)‎‏ جایگزین شد. در تکنیک ‏RRBS‏ ‏ترکیبی از آنزیم های محدود کننده و توالی یابی بی‌سولفیت برای بررسی الگوهای متیلاسیونی در نواحی ‏غنی از ‏CpG‏ مشخص مورد استفاده قرار می گیرد. در این روش ابتدا ‏DNA‏ توسط آنزیم محدود کننده ‏غیر حساس به متیله شدن (‏MspI‏) به قطعات کوتاه برش داده می شود. در انتهای این قطعات کوتاه، دی ‏نوکلئوتیدهای ‏CpG‏ هستند. آنزیم ‏MspI‏ توالی های ‏‎5′-CCGG-3’‎‏ را شناسایی می کند. قطعات غنی از ‏CpG‏ قبل از تیمار با بی سولفیت و ‏PCR‏ انتخاب می گردند. این قطعات باید به طول 40 تا 220 ‏bp‏ ‏باشند و در 85 درصد نواحی ‏CpG‏ حضور داشته باشند. سپس، در مرحله بعد تیمار بی سولفیت انجام ‏می گیرد و سیتوزین های متیله شده از تبدیل بی سولفیت محافظت می شوند، بنابراین هنوز در آنالیز به ‏عنوان سیتوزین خوانده می شوند. ‏DNA‏ تیمار شده با بی سولفیت قبل از تعیین توالی توسط ‏PCR‏ ‏تقویت می شود. سپس، توالی یابی نسل بعدی بر روی توالی های تکثیر شده انجام می شود. رایج ترین ‏گردش کار ‏RRBS‏ از پلتفرم ‏Illumina NGS‏ استفاده می کند. پس از اتمام تعیین توالی، آخرین مرحله ‏در پروتکل ‏RRBS‏ تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی است که شامل ترازبندی توالی‏ و شناسایی متیلاسیون ‏است. پروتکل های مبتنی بر ‏RRBS‏ مقرون به صرفه تر از توالی یابی بی سولفیت کل ژنوم ‏WGBS‏ ‏هستند، زیرا این روش ها بر تقویت مناطق غنی از ‏CpG‏ در نزدیکی توالی تشخیص آنزیم محدود کننده ‏تمرکز دارند.‏
مزایای روش:‏
‏1)‏ پوشش دهی بالای نواحی جزایر ‏CpG‏ (‏CGI‏)‏
‏2)‏ حساسیت بالا
‏3)‏ مقرون به صرفه بودن در مقایسه با ‏WGBS
‏4)‏ نیاز به ‏DNA‏ کمتر (10-300 ‏ng‏)‏
محدودیت های روش:‏
‏1)‏ پوشش دهی پایین در عوامل تنظیمی دور و مناطق داخل ژنی
‏2)‏ تخریب قابل توجه ‏DNA‏ پس از تیمار با بی سولفیت
‏3)‏ محدود به مناطق نزدیک به سایت های شناسایی آنزیم ها
‏4)‏ عدم افتراق بین ‏‎5MC‎‏ و ‎5hmC‎
آنالیز داده:‏
فرآیند کلی تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی داده های متیلاسیون ‏DNA‏ شامل پردازش داده ها، کمّی ‏سازی سطح متیلاسیون ‏DNA، تعیین پروفایل عمومی، شناسایی DMR‏ (مناطق با متیلاسیون متفاوت) ‏و تجسم متیلوم است. کنترل کیفیت داده ها با استفاده از نرم افزار ‏FastQC‏ انجام می شود.‏
ابزارهای آنالیز اطلاعات ‏RRBS‏:‏
BS Seeker، ‏Bismark‏ و BSMAP‏ ابزارهای مناسب برای خوانش ردیف های توالی یابی بی‌سولفیت هستند. ‏BS Seeker‏ ردیف یابی و فراخوانی متیلاسیون را انجام می دهد ولی نسبت متیلاسیون یا نمرات بتا را ‏محاسبه نمی کند. الگوریتم ‏Bicycle‏ قادر به انجام تمام مراحل محاسباتی ضروری است و برای سیستم ‏عامل های مختلف عمومیت دارد. Bicycleبه علت استفاده آسان تر و عملکرد بالا بهترین ابزار محاسباتی ‏مورد پسند کاربران به خصوص دانشمندان بدون دانش محاسباتی می باشد. ‏SMAP‏ یک نمونه عالی ‏پایپلاین‏ است که تنها برای داده های ‏RRBS‏ مناسب است. MOABS‏ نیز یکی از قدرتمندترین ‏پایپلاین های خطی است که برای آنالیز داده های ‏WGBS، ‏RRBS‏ و ‏‎5hmC‎‏ کاربرد دارد و برای کاربران ‏با تجربه و متخصص انتخاب مناسبی است. ‏Genestack.com‏ ‏‎(https://genestack.com)‎‏ یک پلتفرم ‏آنلاین برای آنالیز انواع داده های متیلاسیون از جمله ‏WGBS‏ و ‏RRBS‏ است که در آن می توان داده ‏های شخصی خود را بارگذاری و تحلیل کرد. ‏

مشخصات تراز بندی را می توان با ابزارهایی مانند‏ UCSC genome ‎browser، ‏‎WBSA،‏ Integrative Genome Viewer ‏و ‏Methylation plotter‏ ترسیم کرد که منجر به وضوح بیشتر در سطح ‏یک باز در سراسر ژنوم می شود. ‏

کاربرد بالینی: ‏
‏1)‏ تشخیص تغییر الگوهای متیلاسیون در تومورها نسبت به بافت طبیعی (همچون سرطان دهان، ‏معده، کولورکتال، سینه و لنفوم)‏
‏2)‏ تعیین الگوهای متیلاسیون در زمینه بیماری های اعصاب مانند هانتیگتون ‏‎(HD‎ ‎)‎‏ و سندرم داون ‏‎(DS‎ ‎)‎
‏3)‏ تعیین تغییر الگوهای متیلاسیون ‏DNA‏ در پانکراس افراد دیابتی

معایب روش های تیمار با بی سولفیت:

در واکنش تیمار ‏DNA‏ با بی سولفیت، ‏DNA‏ غیر مکمل ایجاد می شود. بنابراین، یکی از آن ها برای ‏روش های پایین دستی برای تشخیص کاربرد دارد، در حالی که یک رشته دیگر ممکن است منبع آلودگی ‏در روش های مرتبط باشد. بنابراین، انتخاب رشته مناسب برای مطالعات متیلاسیون مهم است. در مرحله ‏بعد، ‏DNA‏ استخراج شده از جمعیت های مختلف سلولی و تحت تیمار با بی سولفیت، در تشخیص ‏وضعیت متیلاسیون مشکل ایجاد می کند. گاهی اوقات تیمار بی سولفیت ‏DNA‏ به صورت ناقص انجام ‏می شود، که بر رویکردهای پایین دست تأثیر می گذارد. علاوه بر این، میزان تکثیر رشته های متیله و ‏غیر متیله متفاوت و همراه با سوگیری است که می تواند میزان متیلاسیون را مختل کند. علی رغم ‏مشکلات روش های مبتنی بر بی سولفیت، کمّیت و کیفیت ‏DNA‏ ورودی و کیفیت واکنش بی سولفیت ‏در این فرایند حیاتی است. می توان اشاره کرد که دناتوراسیون ناقص قبل از واکنش بی سولفیت، مدت ‏زمان انکوباسیون، کالیبراسیون ‏‎ PH‏ ‏‎= 5.4)‎‏)، حساسیت به تخریب ‏DNA‏ و مقدار ‏DNA‏ تخلیص شده در ‏تیمار بی سولفیت مشکل ساز است.‏
علاوه بر این، تیمار بی سولفیت ‏DNA‏ نمی تواند ‏‎5mC‎‏ و ‏‎5hmC‎‏ را روی دی نوکلئوتیدهای ‏CpG DNA‏ ‏تشخیص دهد. پس از آن، ‏‎5hmC‎‏ به سیتوزین-5-متیل سولفونات تبدیل می شود که در تعیین توالی و ‏تکثیر به عنوان سیتوزین خوانده می شود. بنابراین، روش های مربوط به بی سولفیت برای الگوی ‏‎5hmC‎‏ ‏ژنوم خیلی قابل اعتماد نیستند.‏

تکنیک های مبتنی بر میل پیوندی

مطالعات مختلفی نشان می دهد که گروه متیل را می توان از طریق برخی از پروتئین هایی که با عوامل ‏رونویسی همکاری می کنند، مانند دومین اتصال دهنده متیل (‏MBD ‏) در سلول ها مورد هدف قرار داد. ‏از سوی دیگر، برخی از آنتی بادی ها نیز می توانند به عنوان تقویت کننده میل ترکیبی به گروه متیل ‏عمل کنند. بنابراین، هر دو روش می توانند برای تشخیص متیل سیتوزین در داخل ژنوم اعمال شوند. ‏لازم به ذکر است که مناطق غنی از ‏CpG‏ متیله شده بیشتر از مناطق فاقد ‏CpG‏ به پروتئین ها متصل ‏می شوند. در این رویکرد به وسیله ایمونوپرسیپیتاسیون آنتی بادی پروتئین های ‏‎ MBD، قطعه متیله از ‏غیر متیله جدا می شود.‏
رسوب دهی ایمنی ‏DNA‏ متیله شده ‏‎(MeDIP‎ ‎)‎‏ مولکول های تک رشته ای و ‏MBD‏ مولکول ‏DNA‏ دو ‏رشته ای را هدف قرار می دهد. اگرچه این رویکردها ابزارهای کارآمد و سریعی برای تکنیک های پایین ‏دست مانند ‏PCR، اری-هیبریداسیون و تعیین توالی نسل بعدی هستند، اما قادر به تشخیص وضعیت ‏متیلاسیون خارج از جزایر ‏CpG‏ یا یک دی نوکلئوتید ‏CpG‏ نیستند. تفاوت بین روش های ‏MeDIP‏ و ‏MBD‏ در این است که آنتی بادی اختصاصی در ‏MeDIP‏ پس از دناتوراسیون به ‏DNA‏ تک رشته ای ‏متصل می شود و برای تشخیص مناطق ‏CpG‏ کم تراکم مفید است، در حالی که روش مبتنی بر ‏MBD‏ ‏قطعات متیله دو رشته ای با تراکم ‏CpG‏ بالاتر به ویژه جزایر ‏CpG‏ را هدف قرار می دهد.‏

Methylated DNA immunoprecipitation -1‏

روش ‏MeDIP‏ مبتنی بر آنتی بادی علیه گروه های متیل است که تمامی متیلاسیون های پایین دست را ‏از مقیاس کوچک تا بزرگ آنالیز می کند. این روش ابتدا توسط ‏Weber‏ و همکارانش در سال 2005 با ‏هدف کمک به ارزیابی متیلاسیون در سطح ژنوم انجام شد. در این تکنیک، مقدار کمی از ‏DNA‏ ‏استخراج شده (‏‎~2 μg‎‏) با روش سونیکیشن برش داده می شود و با طول قطعات متفاوتی بین 300 تا ‏‏1000 جفت باز است. هرچه قطعات کوتاه تر باشد کارایی این روش ارتقا می یابد. اندازه قطعات آماده ‏شده، دناتوراسیون کامل و تولید ‏DNA‏ تک رشته ای از عوامل موثر در اتصال آنتی بادی های مونوکلونال ‏‎5mC‎‏ هستند. پس از انکوباسیون قطعات با آنتی بادی های اختصاصی، نوبت اجرای ایمونوپرسیپیتاسیون ‏است. در این روش با اتصال بیدهای مغناطیسی به آنتی بادی های مربوط به ‏‎5mC‎، ‏DNA‏ غیر متیله جدا ‏می شود. سپس، ‏DNA‏ متیله متصل به آنتی بادی در مجاورت پروتئیناز ‏k‏ قرار می گیرد تا آنتی بادی ها ‏حذف و قطعات ‏DNA‏ متیله باقی بماند. به منظور تشخیص متیلاسیون این قطعات ‏DNA‏ از روش های ‏PCR‏ سنتی تا توالی یابی نسل بعد استفاده می شود. رایج ترین روش برای تعیین پروفایل ‏متیلاسیون ‏DNA‏ میکرواری با توان بالاست. همان طور که مشخص است، به دلیل اختصاصیت آنتی بادی ‏برای‎5mC ‎، این روش می تواند ‏‎5mC‎‏ را از ‏‎5hmC‎‏ بر روی ژنوم متمایز کند. وضوح و حساسیت تکنیک ‏MeDIP‏ وابسته به فرآیندهای قابل اجرا در پایین دست مانند هیبریداسیون اری با وضوح بالا، توالی یابی ‏MeDIP-seq ‎، ‏MeDIP-ChIP‏ ، ‏Quantitative real-time PCR‏ (‏qPCR‏) و ‏PCR‏ سنتی است.‏

2- MBD proteins affinity approach‏ ‏

پروتئین های ‏MBD‏ وضعیت متیلاسیون ‏DNA‏ را به کمپلکس های مربوط به کروماتین مثل عوامل ‏رونویسی ترجمه می کنند. این روش، به دلیل اتصال به مناطق ‏CpG‏ متیله شده، نه تنها برای یافتن ‏DMR‏ (مناطق با متیلاسیون متفاوت) در ژنوم مناسب است، بلکه برای مطالعات متیلاسیون در ژنوم نیز ‏کاربرد دارد. ‏DNA‏ استخراج شده توسط اندونوکلئاز ‏MseI‏ هضم شده و با کمپلکس ‏MBD2b/MBD3L1‎‏ ‏مجاور می شود. قطعات ‏DNA‏ هدف از طریق برچسب گذاری ‏MBD2b GST‏ و بیدهای گلوتاتیون جمع ‏می شوند.‏ نتایج حاصل از رویکرد پروتئین ‏MBD، که وابسته به ظرفیت پروتئین های ‏MBD‏ برای اتصال ویژه به ‏توالی ‏DNA‏ متیله شده است، می تواند با استفاده از میکرواری (‏MBD-chip‏) یا فناوری های توالی یابی ‏‏(‏MBDCap-seq/MethylCap-seq‏) ارزیابی شود.‏

 

این مطلب را پسندیدید؟

-

به اشتراک بگذارید

Share on facebook
Share on twitter
Share on linkedin
یک پاسخ بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.فیلد هایی که با علامت ستاره 8 مشخص شده اند، الزامی هستند

X