جدول محتوا
میکرواری
- دسته بندی: مطالعات امیکس
- نویسنده: مدیر ایده زیست
جدول محتوا
میکرواری (ریزآرایه یا microarray) یکی از تکنولوژی های پرکاربرد در علوم بیولوژیک می باشد که در چند دهه ی اخیر بسیار مورد توجه محققان قرار گرفته است. از نظر تاریخی، ابداع این روش را می توان مدیون تلاش های جوزف دِرسی و همکارانش در اواسط دهه ی 1990 دانست. اساس این تکنولوژی هیبریداسیون بازهای مکمل در رشته ی RNA مجهول با کاوشگرهای (probe) موجود در سطح آرایه میکرواری می باشد. به طور کلی، پروتکل آزمایشگاهی میکرواری را به دو روش میکرواری تک رنگ و دو رنگ می توان تقسیم کرد که در مراحلی چون هیبریداسیون، استفاده از رنگ های فلورسنت، مراحل خوانش و نحوه آنالیز داده ها با یکدیگر تفاوت دارند. آنالیز داده های میکرواری در چند مرحله ی آنالیز تصویر، پیش پردازش داده ها و نرمال سازی آن ها، کنترل کیفی داده ها، تعیین ژن های افتراقی و آنالیز مسیر های بیولوژیکی می توان تقسیم بندی کرد. با توجه به افزایش روز افزون کاربرد این تکنیک در مطالعات مختلف، حجم وسیعی از داده های میکرواری تولید می شوند که این داده ها در پایگاه های داده ذخیره می شوند. از مهمترین پایگاه های داده که داده های میکرواری را نیز در بر می گیرند می توان به GEO و ArrayExpress اشاره کرد.
از میکرواری در تشخیص بیماری ها، کشف دارو، تجزیه و تحلیل پزشکی دارویی، تشخیص پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی، بررسی اتصال فاکتورهای رونویسی و تعیین مقاومت به آنتی بیوتیک ها می توان استفاده کرد. با توجه به کاربردهای وسیع این تکنیک، کمپانی های بسیاری در این حوزه فعالیت می کنند که معروف ترین آن ها کمپانی های Affymetrix، Illumina و Agilent می باشند. در این محتوای آموزشی قصد داریم تا در رابطه با جنبه های مختلف میکرواری از جمله تاریخچه، اساس روش، ساختار چیپ، پروتکل آزمایشگاهی، کمپانی های مهم، آنالیز داده ها، پایگاه های داده و کاربردهای این تکنیک به طور مفصل شرح دهیم
مقدمه
اصول زیست شناسی مولکولی در مفهومی به نام Central Dogma خلاصه شده است که بیان می دارد روند انتقال اطلاعات ژنتیکی از DNA به RNA و سپس به پروتئین انتقال می یابد. مولکول DNA حاوی اطلاعات زیستی است که با یک الفبای چهار حرفی رمز گذاری شده است. A (آدنین)، T (تیمین)، C (سیتوزین) و G (گوانین) حروف این الفبا را تشکیل می دهند. با قرارگیری این حروف در کنار یکدیگر توالی DNA ساخته می شود که اطلاعات ژنتیکی را در بر می گیرد. این اطلاعات ساختار و عملکرد یک ارگانیسم را مشخص می کنند. در طی فرآیندی به نام رونویسی، بخشی از DNA که ژن نامیده می شود به یک مولکول تک رشته ای که RNA نام دارد، رونویسی می شود. مولکول RNA دارای یک الفبای چهار حرفی مشابه DNA می باشد، با این تفاوت که در RNA باز T با U (یوراسیل) جایگزین می شود. نوع خاصی از RNAها که حاوی اطلاعاتی برای ترجمه به پروتئین هستند، RNA پیامبر (mRNA) نامیده می شوند زیرا این RNAها یک ناقل فیزیکی می باشند که به عنوان یک میانجی، اطلاعات ژنتیکی را از هسته به سیتوپلاسم حمل می کنند. درون سیتوپلاسم، ریبوزوم ها با کمک اطلاعات مولکول های mRNA و با فرآیندی به نام ترجمه پروتئین ها را می سازند. در واقع، مولکول DNA به عنوان یک الگو، مولکول mRNA به عنوان یک ناقل و مولکول پروتئین به عنوان یک مولکول عمل کننده مطرح است.
با بررسی غیر مستقیم mRNAهای مختلف، می توانیم اطلاعات ژنتیکی و بیان ژن ها را بسنجیم. این فرآیند به درک بهتر فرآیندهای زمینه ای که در تغییر بیان ژن ها موثر می باشند کمک می کند. باید به این نکته توجه کرد که مولکول mRNA مولکول حساسی است و به سرعت توسط آنزیم های RNase و ترکیباب شیمیایی مختلف تخریب می گردد. بنابراین برای سنجش mRNA، از روی آن مولکولی به نام cDNA یا DNA مکمل (complementary DNA) ساخته می شود که از پایداری بیشتری برخوردار است.
بررسی همزمان تعداد زیادی از ژن ها با استفاده از روش های سنتی و قدیمی ممکن نمی باشد. با استفاده از روش میکرواری می توان در یک واکنش سریع بیان بسیاری از ژن ها را به طور موثری بررسی نمود. DNA-میکرواری جامعه ی محققان را قادر ساخته است تا بتوانند جنبه های اساسی زمینه ساز رشد و تکامل زندگی و همچنین علل ژنتیکی ناهنجاری های مختلفی که در عملکرد بدن رخ می دهند را شناسایی کنند. در یک میکرواری معمول، هیبریداسیون بین مولکول mRNA و DNA مکمل رخ می دهد. مقدار mRNA متصل شده به هر ناحیه در آرایه نشان دهنده ی سطح بیان در ژن های مختلف می باشد. تعداد این ژن ها می تواند به هزاران ژن برسد. تمامی داده ها جمع آوری می شوند و پروفایل بیان ژن در سلول ها تعیین می گردد.
تاریخچه
آغاز ساخت فناوری DNA میکرواری از مطالعات هبیریداسیون کلنی گرونشتاین و هوگنس در سال 1975 بوده است. در این مطالعه، DNA مورد نظر به طور تصادفی در پلاسمیدهای اشریشیا کلی که روی صفحات پتری آگارِ پوشانده شده با فیلترهای نیتروسلولز قرار داده شده بود، کلون شد. کلونی های موجود در این فیلترها لیز گردید و DNA آن ها دناتوره و بر روی فیلترها تثبیت شد تا یک مجموعه ی تصادفی و غیرمنظم از لکه های DNA (به عنوان کاوشگر) که قطعات کلون شده را نشان می دهد ایجاد شود. از هیبریداسیون DNA و RNA هدف که با مواد رادیواکتیو برچسب شده بود استفاده شد تا 1000 کلون باکتری به سرعت غربالگری شوند و کلون هایی که حاوی DNA جفت شونده با کاوشگر ها بودند شناسایی شوند.
در سال 1979، گِرگان و همکارانش با تعدیل کردن روش گرنشتاین آرایه های مرتب شده را ساختند. در این فرایند، کلنی های باکتری را در یک میکروپلیت 144 چاهکه قرار دادند. این گروه یک دستگاه مکانیکی واجد 144 پین ساختند و با استفاده از ترفند خاصی پلیت های میکروتیتر متعددی را روی آگار تکثیر دادند و آرایه هایی از 1728 کلنی مختلف را در یک منطقه 38×26 سانتی متر ایجاد کردند. آن ها ابتدا کلنی ها را به مربع های کاغذ فیلتر واتمن انتقال دادند و پس از رشد، آن ها را لیز کرده و DNA آن ها را دناتوره کردند. در مرحله ی بعد DNA را در سطح فیلتر تثبیت کردند تا بتوانند چندین بار از آن ها استفاده کنند. در چند دهه پس از ابداع این روش، از آرایه های مبتنی بر فیلتر ها و پروتکل های مشابه این در موارد مختلفی مثل کلون کردن ژن های خاص و شناسایی SNP ها، کلون کردن ژن هایی با بیان افتراقی بین گروه های مورد مطالعه و نقشه برداری فیزیکی استفاده گردید.
در اواخر 1980 و اوایل 1990 گروه هانس و همکارانش، با استفاده از سیستم های رباتیک این فرآیندها را برای آرایه کردن سریع کلون ها از پلیت های میکروتیتر به فیلتر ها خودکار سازی کردند. توسعه همزمان کلون کردن cDNA در اواخر دهه 1970 و اوایل دهه 1980 با پروژه های توالی یابی ژنوم و ترانسکریپتوم انسان، منجر به تلاش هایی برای ساخت cDNA مرجع و آرایه هایِ فیلتر cDNA برای ژنوم انسان و سایر ژنوم ها شد. در اواخر دهه 1990 و اوایل سال 2000، مجموعه ای از cDNA های غیر تکراری به صورت گسترده در دسترس قرار گرفت. همچنین وجود سکانس کامل ژنوم برخی از ارگانیسم ها، ساخت مجموعه ای از محصولات را که نشان دهنده ی تمام ORF ها در ژنوم های کوچک بودند را ممکن ساخت. وجود همزمان این مجموعه ها و فناوری رباتیک، این امکان را فراهم کرد تا هر آزمایشگاه آرایه های cDNA یا ORF خود را که حاوی اکثر ژن های موجود در ژنوم است را بسازد. در اواسط دهه ی 1990، جوزف دِرسی و همکارانش با توسعه ی روش میکرواری بررسی همزمان هزاران ژن را ممکن ساختند. این آرایه از طریق چاپ پرسرعت cDNA بر روی شیشه و با استفاده از فناوری رباتیک ساخته شده بود. در سال 1997، محققین دانشگاه استنفورد اولین مطالعه ی میکرواری ژنوم کامل را بر روی ژنوم مخمر منتشر کردند.
اساس روش میکرواری
اساس تکنولوژی میکرواری و همچنین روش های سنتی بررسی بیان ژن مثل Southern blot و Northern blot هیبریداسیون نوکلئوتید های مکمل طبق قوانین واتسون-کریک” می باشد. هیبریداسیون، انتخابی دقیق از اسید های نوکلئیک مکمل را با حساسیت و ویژگی بالا فراهم می کند. در تکنولوژی میکرواری، سطح جامد (مثل شیشه) دارای صد ها تا هزاران DNA غیر متحرک است که به صورت همزمان می توانند با نمونه ی cDNA برچسب شده با رنگ های فلورسنت مختلف هیبرید شوند. همانطور که پیش از این اشاره شد، اساس میکرواری اتصال DNA شناخته نشده و DNA شناخته شده بر اساس قوانین واتسون-کریک به یکدیگر می باشد. DNA شناخته شده در واقع همان DNA کاوشگر است که هزاران عدد از آن در سطح جامد به صورت غیر متحرک قرار دارد. در مقابل DNA ناشناخته همان DNA ای است که می خواهیم سطح بیان ژن ها را در آن بسنجیم و با مولکول های گزارشگر فلوئوروفور (که به دلیل خطرات زیستی مواد رادیواکتیو با آن ها جایگزین شده است) برچسب (tag) شده اند. پس از هیبریداسیون DNAهای مکمل، با تابش لیزر، پرتو فلورسنت از فلوئوروفور های تحریک شده ساطع می شود. با استفاده از یک کامپیوتر الگوهای تابش فلورسنت ثبت می شوند و برای شناسایی DNA ناشناخته از آن استفاده می شود. این روش دارای سرعت، حساسیت و ویژگی بالا برای شناسایی چندین هزار قطعه ی DNA به طور همزمان می باشد.
ساختار چیپ ها
چیپ ها ساختارهای از جنس شیشه، شیشه روکش دار، سلیکون یا پلاستیک می باشند که تعداد زیادی کاوشگر (پروب) در سطح آن ها قرار گرفته است و توانایی بررسی هزاران ژن را به طور همزمان دارند. اندازه چیپ حدودا برابر با اندازه ی یک لام میکروسکوپی نرمال (75×25 میلیمتر) است. ناحیه ی مربوط به آرایه ها در مرکز این چیپ قرار گرفته است و مشابه یک صفحه شطرنجی به ابعاد 5/12×5/12 میلیمتر است. هر مربع کوچک که در سطح آرایه قرار دارد به ابعاد 11×11 میکرومتر (عرض هر آرایه چیزی حدود یک پنجم عرض موی انسان است!) می باشد و فقط یک نوع کاوشگر (اختصاصی یک هدف) در سطح آن قرار دارد. آخرین آرایه های تولید شده برای سنجش ژنوم انسان حدودا 3/1 میلیون از این مربع ها در سطح خود دارند. این میزان برای شناسایی حدودا 47.000 مولکول RNA مختلف مناسب است که عملا هر ژن شناخته شده ی انسانی که بیان می شود و در نهایت به پروتئین تبدیل می شود را در بر می گیرد. هر کدام از کاوشگرها طولی حدود 25 باز دارند و به صورت عمودی در سطح آرایه قرار گرفته اند. این کاوشگر ها به کمک فناوری به نام “شیمی ترکیبی” ساخته می شوند. این فناوری قدرتمند در کمتر از 100 مرحله می تواند رشته های DNA بیشتری نسبت به ستاره های موجود در کهکشان راه شیری را بسازد. این الیگونوکلئوتید ها با استفاده از تکنولوژی رباتیک در سطح قطعه ی چیپ قرار می گیرند. به منظور دستیابی به حساسیت و اختصاصیت بالا، از دو دسته کاوشگر در سطح آرایه استفاده می شود:
- (1) دسته ی اول طراحی شده اند تا به طور کامل به سکانس مورد نظر جفت شوند
- (2) دسته ی دوم دارای یک نوکلئوتید تغییر یافته در نوکلئوتید 13 خود هستند. هدف از استفاده ی این دو دسته کاوشگر تمایز دقیق تر بین سیگنال های واقعی و سیگنال های ناشی از رشته های مکمل تصادفی می باشد.
روش آزمایشگاهی میکرواری دو رنگ
پروتکل آزمایشگاهی میکرواری را به پنج مرحله تقسیم کرد:
- (1) طراحی آزمایش
(2) آماده سازی نمونه ها و برچسب زدن به آن ها
(3) هیبریداسیون
(4) شستشو
(5) تصویر برداری
1- طراحی و اجرای آزمایش
طراحی مناسب آزمایش بخش بسیار مهمی برای شروع آزمایش میکرواری است. به عبارت دیگر اگر یک کار را خوب شروع کنید، نیمی از آن را انجام داده اید. اگر طراحی آزمایش به طرز عالمانه ای انتخاب شود، بسیاری از اطلاعات به راحتی استخراج می شوند و زحمت تجزیه و تحلیل کاهش می یابد. در بسیاری از موقعیت ها که طراحی مطالعه مناسب باشد، نتایج مهم از بررسی بصری داده ها مشهود است. یک آزمایش میکرواری معمولا از ده ها هزار عنصر تشکیل شده است. تجزیه و تحلیل حجم زیادی از داده ها، می تواند برای پژوهشگران مشکل و دلهره آور باشد. بنابراین، طراحی دقیق پروژه ی میکرواری برای تولید داده های با کیفیت و به حداکثر رساندن بازده تجزیه و تحلیل داده ها از هر زمان دیگری مهم تر است.
یک طراحی خوب آزمایش میکرواری باید حداقل شامل چهار عنصر باشد:
الف) یک سوال و یا فرضیه زیستی مشخص و واضح
ب) درمان استفاده شده در مطالعه، نظارت بر مواد زیستی و پروتکل های استفاده شده در میکرواری باید تحت تاثیر حداقل میزان خطای سیستماتیک و آزمایشی باشد.
پ) یک طراحی آزمایش میکرواری ساده، معقول و مناسب از نظر آماری که حداکثر میزان اطلاعات را با توجه به ساختار هزینه و پیچیدگی مطالعه بدهد.
ت) انطباق با استانداردهای جمع آوری اطلاعات میکرواری که در MGED و MIAME ذکر شده اند.
علاوه بر این، تکرار آزمایش میکرواری برای بدست آوردن تنوع در ژن ها و محاسبه ی آماری ضروری است. بنابراین توصیه شده است که هر آزمایش میکرواری به صورت سه نسخه ای انجام شود تا اطمینان به داده ها افزایش یابد. در میکرواری دو نوع تکرار وجود دارد: تکرار بیولوژیک و تکرار تکنیکال. تکرار بیولوژیکی به معنی آنالیز چندین نمونه ی مستقل می باشد (برای مثال یک نوع بافت بدست آمده از بیماران مختلف با یک بیماری مشترک، یا نمونه ی یک رده ی سلولی خاص از افرادی که تحت درمان یکسان قرار دارند.) در حالی که تکرار تکنیکال به معنی تکرار آزمایش میکرواری با استفاده از همان نمونه های RNA استخراج شده است (تکرار آزمایش روی یک نمونه). اگر بافت یا منابع کافی برای چند بار تکرار میکرواری وجود نداشته باشد، به شرط این که مراحل آزمایش با دقت انجام شوند، معمولا تکرار بیولوژیکی به تکرار تکنیکال ترجیح داده می شود.
2- آماده سازی نمونه ها و برچسب زدن به آن ها
در مرحله ی اول، باید mRNA از نمونه های بیولوژیکی مثل خون، تومور و بافت مورد نظر استخراج شده و تخلیص گردد. در طراحی مطالعه باید حداقل دو گروه انتخاب گردند (برای مثال بافت سالم و بافت فرد بیمار). در این روش پرایمر پلی T به mRNA متصل می شود تا فرآیند رونویسی معکوس از ناحیه ی سیگنال پلی آدنیلاسیون یعنی 3’ UTR در انتهای mRNA آغاز شود. نسبت هایی از اسید های نوکلئیک dATP، dGTP ،dCTP و dTTP که به یک رنگ فلورسنت به صورت کووالان متصل شده اند به واکنش اضافه می شوند. در میکرواری دو رنگ، نمونه های بیمار و سالم با دو رنگ متفاوت مثل Cy3 (که با لیزر سبز تهییج می شود) و Cy5 (که با لیزر قرمز تهییج می شود) برچسب می شوند تا بین دو گروه تمایز ایجاد شود و بتوان آن ها را به طور همزمان در یک میکرواری سنجید. دو نمونه ی بیمار و کنترل در یک لوله با یکدیگر ترکیب می شوند و آماده ی مرحله ی هیبریداسیون می گردند.
3- هیبریداسیون
در این مرحله cDNA ساخته شده به چیپ اضافه می شود و کاوشگر DNA در سطح اسلاید به مولکول cDNA برچسب خورده با فلورسنت جفت می شود. این مرحله می تواند به صورت دستی و یا با استفاده از سیستم های رباتیک انجام شود. در روش دستی، آرایه میکرواری در یک محفظه مخصوص قرار می گیرد و محقق محلول حاوی cDNA هدف را در شرایط استریل به آن تزریق می کند و آن را در دمای مشخص به مدت 12 تا 24 ساعت انکوبه می کند. در روش دوم، تمام پروسه به وسیله ی یک ربات برنامه ریزی شده انجام می شود. استفاده از ربات ها باعث صرفه جویی در زمان و کاهش زحمت روش دستی، انجام پروتکل در یک جایگاه اختصاصی و همچنین کنترل بهتر روی دمای آزمایش (که معمولا بین 45 تا 65 درجه ی سانتی گراد است) می شود. هچنین باید به این نکته ی مهم توجه کرد که مرحله ی هیبریداسیون تحت تاثیر عواملی همچون غلظت نمک، دما، غلظت فرم آمیدی، رطوبت و میزان محلول حاوی DNA هدف قرار می گیرد. برای مثال دمای بالا و غلظت بالای نمک باعث افزایش سختگیری در هیبریداسیون می شود، به این معنا که باعث افزایش اختصاصیت اتصال کاوشگرها به هدف می شود و در مقابل باعث کاهش اتصال سکانس های هدفی که به طور 100 درصد با کاوشگر خود جفت نیستند می گردد. به منظور کاهش و جلوگیری از کراس هیبریداسیون (به معنی اتصال رشته هایی می باشد که در حقیقت مکمل یکدیگر نیستند)، می توان یک توالی تکراری DNA و پلی T برای پوشاندن توالی های تکراری در سطح ژنوم و یک توالی تکراری DNA و پلی A برای پوشاندن مکان های پلی آدنیلاسیون در cDNA استفاده کرد.
4- مرحله ی شستشو
در این مرحله باید محلول اضافی هیبریداسیون را از روی چیپ میکرواری حذف کرد. با انجام این مرحله ی حیاتی می توان اطمینان حاصل کرد که در مرحله ی تصویر برداری، فقط cDNA برچسب خورده که به کاوشگر هیبرید شده است سنجیده خواهد شد و cDNA های آزاد با ایجاد سیگنال غیراختصاصی، در مرحله ی تصویر برداری اختلال ایجاد نخواهند کرد. علاوه بر این، مرحله شستشو با کاهش کراس هیبریداسیون باعث افزایش سختگیری و دقت می شود. برای شستشو می توان از محلول هایی با غلظت نمک پایین که حاوی سدیم دودسیل سولفات (SDS) 0.1× و سالین سیترات استاندارد 0.1x هستند استفاده کرد. در روش اتوماتیک، چرخه های شستشو به صورت خودکار انجام خواهند شد.
5- مرحله ی تصویر برداری
مرحله ی تصویر برداری را می توانیم به عنوان مرحله ی نهایی قسمت آزمایشگاهی میکرواری در نظر بگیریم. در این مرحله پرتو دو لیزر با طول موج مناسب برای تهییج فلوروکروم های Cy3 و Cy5، که متصل به cDNA هیبرید شده با کاوشگر هستند، تابیده می شود و پرتو فلورسنت در محدوده ی طول موج معینی از آن ها ساطع می شود. سپس چیپ در زیر اسکنر قرار داده می شود تا خوانش از آن صورت گیرد. در تکنولوژی میکرواری دو رنگ، پس از انجام مرحله ی اسکن نقاطی با سه رنگ متفاوت دیده می شوند. برای مثال اگر نمونه ی کنترل با رنگ قرمز و نمونه بیمار با رنگ سبز رنگ آمیزی شده باشد، نقاط قرمز در سطح آرایه نشان دهنده ی بیان ژن هیبرید شده در گروه کنترل، نقاط سبز به معنی بیان ژن در گروه بیمار و نقاط زرد به معنی بیان ژن مورد نظر در هر دو گروه می باشد. به منظور افزایش دقت خوانش، اپتیک ها بر روی کل اسلاید میکرواری قرار می گیرند تا بتوانند هر نقطه از آن را خوانش کنند. همچنین اندازه ی پیکسل ها را به اندازه ی یک نقطه ی لیزر در سطح میکرواری تنظیم شود تا این اطمینان حاصل گردد که منشاء پرتو خوانش شده از نقاط همسایه در سطح میکرواری نمی باشد.
روش آزمایشگاهی میکرواری تک رنگ و مقایسه ی آن با روش دو رنگ
در روش میکرواری تک رنگ، روش آماده سازی نمونه ها کاملا مشابه با روش دو رنگ می باشد. در مرحله ی اول mRNA ای که قرار است سنجیده شود، از نمونه ها (نظیر خون، بافت و سایر موارد) استخراج می گردد. با استفاده از پرایمر پلی T، رونویسی معکوس از ناحیه 3’UTR موکول های mRNA آغاز می شود. نسبت هایی از اسید های نوکلئیک شامل dATP، dGTP، dCTP و dTTP که به رنگ فلورسنت متصل شده اند، به واکنش اضافه می شوند. در روش تک رنگ برخلاف روش دو رنگ، نمونه های سالم و بیمار با استفاده از یک نوع رنگ مشابه (فایکواریترین، سیانین-3 (Cy3) یا سیانین-5 (Cy5) برچسب می شوند. برخلاف روش دو رنگ، در روش تک رنگ نمونه های دو گروه مطالعه با هم ترکیب نمی شوند و هر نمونه به صورت جداگانه و با یک میکرواری مجزا سنجیده می شود. پس از اضافه نمودن cDNA به میکرواری و انجام مرحله ی انکوباسیون، رشته های مکمل به یکدیگر متصل می شوند. هیبریداسیون در روش تک رنگ مشابه روش دو رنگ تحت تاثیر عواملی چون غلظت نمک، دما، غلظت فرم آمیدی، رطوبت و میزان محلول حاوی DNA قرار می گیرد. به منظور کاهش و جلوگیری از کراس هیبریداسیون، می توان یک توالی تکراری DNA و پلی T برای پوشاندن توالی های تکراری در سطح ژنوم و یک توالی تکراری DNA و پلی A برای پوشاندن مکان های پلی آدنیلاسیون در cDNA استفاده کرد. در مرحله ی بعد، شستشو انجام می گیرد تا mRNA های آزاد که به کاوشگر ها متصل نشده اند از روند آزمایش حذف شوند و سیگنال غیر اختصاصی در مرحله ی خوانش ایجاد نکنند. برای شستشو می توان از محلول هایی با غلظت نمک پایین که حاوی سدیم دودسیل سولفات (SDS) 0.1× و سالین سیترات استاندارد (SCC) ×0.1 هستند استفاده کرد. پس از انجام مرحله ی شستشو، چیپ میکرواری اسکن می شود و مرحله ی خوانش صورت می گیرد. داده های حاصل از روش تک رنگ، اساسا با داده های ایجاد شده از روش میکرواری دو رنگ متفاوت می باشند. داده های میکرواری دو رنگ نسبتی از شدت فلورسانس (یعنی نسبت فلورسانس نمونه به فلورسانس مرجع یا کنترل) را نشان می دهند اما داده های میکرواری تک رنگ شدت فلورسانس مطلق را نشان می دهند. فرض بر این است که فلورسانس مطلق به صورت یکنواختی (اگر به صورت خطی نباشد)، مربوط به فراوانی گونه های مختلف mRNA است که به کاوشگرهای آرایه متصل شده اند.
هر دو روش جوانب مثبت و منفی خود را دارند. اولین مزیت روش تک رنگ طراحی ساده و انعطاف پذیر مطالعه می باشد. هیبریداسیون هر نمونه به یک میکرواری، مقایسه بین میکرواری ها و بین گروه های مختلف نمونه ها را تسهیل می کند. به دلیل وجود منابع مختلف تنوع، از جمله ساخت و پردازش میکرواری ها، ناسازگاری داده بین سنجش های مختلف در روش تک رنگ به وجود می آید که از جمله معایب این روش می باشد. این ناسازگاری با به کار گیری تکرار های بیولوژیکی و تکرار های تکنیکال کافی بر طرف می شود. اعتقاد بر این است که آنالیز های دو رنگ به دلیل وجود کنترل داخلی (برخلاف روش تک رنگ، به دلیل این که در روش دو رنگ دو نمونه بر روی یک چیپ بررسی می شوند، بنابراین کنترل داخلی وجود دارد) قوی تر هستند. با این حال روش دو رنگ دارای معایبی چون گرایش رنگ می باشد که این گرایش ها با انجام تکرار های معکوس رنگ (طراحی به روش dye-swap و یا reference design ) قابل کاهش هستند. علاوه بر این، برای تجزیه و تحلیل دو رنگ باید تلاش قابل توجهی انجام شود زیرا RNA مرجع (یا cDNA مرجع)، باید با کیفیت ثابتی در طول دوره ی اندازه گیری ها در دسترس باشد، حتی اگر مطالعه سال ها طول بیانجامد. همچنین انتخاب RNA مرجع کار ساده ای نمی باشد و اختلافات بحث برانگیزی در رابطه با استفاده از RNA مرجعی که شباهت زیادی به RNA های نمونه ها ندارد وجود دارد. در حالی که برخی از آزمایشگاه ها از مخلوط RNA تهیه شده از بافت های مختلف انسانی (مرجع دور نیز نامیده می شود و بدلیل این که بافت های مختلف انسانی را شامل می شود، تقریبا تمامی ژن های انسان را شامل می شود) استفاده می کنند، گاهی بهتر است مجموعه ای از رده های سلولی یا نمونه های بافتی مرتبط که میانگینی از تمام نمونه های موجود در مطالعه می باشند به عنوان منبع RNA مرجع (مرجع نزدیک نیز نامیده می شود و تقریبا تمام ژن هایی که در مطالعه وجود دارند در آن وجود دارند) استفاده شود. علی رغم این تفاوت های اساسی، هر دو روش میکرواری تک رنگ و دو رنگ به طور گسترده ای و با نتایج مشابه قانع کننده مورد استفاده قرار گرفته اند.
فناوری بید چیپ
در فناوری بید چیپ، یک الیگونوکلئوتید برای هدف قرار دادن یک ژن ساخته می شود و به بید سیلیکایی با قطری در حدود میکرومتر متصل می شود. علاوه بر این، یک الیگونوکلئوتید دیگر با توالی منحصر به فرد (به عنوان بارکد مولکولی) به همان بید متصل می شود. به همین شکل، میلیون ها بید برای هزاران هدف ژنی به طور موازی سنتز می شوند و سپس به نسبت مساوی با یکدیگر مخلوط می شوند. به طور جداگانه، اسلایدهای شیشه ای با پوشش سیلیکا ساخته می شوند. این اسلایدها دارای آرایه ای از میلیون ها سوراخ کوچک هستند که اندازه سوراخ ها با سایز بید ها متناسب می باشد. بید ها روی اسلاید ها پخش شده و وارد سوراخ ها می شوند و با استفاده از نیرو های واندروالس درون سوراخ ها تثبیت می شوند. قرار گیری بید ها به صورت کاملا تصادفی می باشد و هر ژن بوسیله ی چندین بید مورد هدف قرار خواهد گرفت. در آزمایش های سنجش بیان ژن، توالی های RNA برچسب شده با فلورسنت به آرایه هیبرید می شوند و پس از تابش لیزر، سیگنال حاصل از تهییج ماده فلورسنت اسکن می شود. برای پی بردن به این که هر بید با کدام ژن متناظر است، از یک استراتژی رمزگشایی هوشمندانه استفاده می شود. همانطور که ذکر شد، تمامی بیدها دارای بارکد منحصر به فرد خود هستند، اما موارد زیر بین هر یک از بیدها مشترک می باشند. در ابتدا یک الیگونوکلئوتید با رنگ سبز، و دیگری با رنگ قرمز کونژوگه شده است و با آرایه هیبرید شده و سیگنال خوانده شده است. تقریبا نیمی از بید ها سیگنال قرمز و نیمی دیگر سیگنال سبز خواهند داشت. برای حذف نوکلئوتیدهای متصل شده، آرایه تحت شرایط دناتوراسیون قرار می گیرد و این فرآیند با جفت رشته های سبز و قرمز متفاوت تکرار می شود. باز هم نیمی از بیدها سیگنال قرمز و نیمی دیگر سیگنال سبز خواهند داشت، اما ممکن است سیگنال آن ها با تکرار قبلی یکسان نباشد. برای مثال، یک بید ممکن است چهار توالی سیگنال داشته باشد: قرمز-سبز، سبز-قرمز، قرمز-قرمز و یا سبز-سبز. این فرآیند همه ی بیدها را به چهار گروه تقسیم می کند. با استفاده از چرخه های هیبریداسیون پی در پی، می توان میلیون ها بید را به طور جداگانه رمزگشایی کرد تا مشخص گردد که کدام نسخه ی ژنی را مورد هدف قرار می دهند. سه کاربرد اصلی پلتفرم آرایه های مبتنی بر بید؛ تعیین ژنوتیپ، کمی سازی رونویسی ژن ها و متیلاسیون سیتوزین می باشد.
محدودیت های فناوری میکرواری
در حالی که فناوری میکرواری کاربردهای گوناگونی دارد، دارای چندین محدودیت نیز می باشند. اولین محدودیت میکرواری اندازه گیری غلظت نسبی به طور غیر مستقیم است. فرض بر این است که سیگنالی که در یک موقعیت معین بر روی ریز آرایه اندازه گیری می شوند متناسب با غلظت یک mRNA فرض شده در نمونه است. همچنین، در اغلب موارد طراحی آرایه هایی که در آن ها چندین توالی RNA یا DNA مرتبط به طور غیر اختصاصی به کاوشگرهای یکسان متصل نشوند مشکل می باشد. یک آرایه DNA فقط می تواند توالی هایی را تشخیص دهد که آرایه برای آن طراحی شده باشد؛ به این معنی که اگر نمونه مورد سنجش با آرایه حاوی گونه هایی از RNA یا DNA باشد که هیچ کاوشگر مکملی در سطح آرایه برای آن وجود نداشته باشد، این DNA و یا RNAها شناسایی نخواهند شد. برای آنالیزهای بیان ژن، این محدودیت به این معنی است که ژن های فاقد حاشیه نویسی در ژنوم، در آرایه وجود نخواهند داشت. همچنین، RNAهای غیر کد کننده که هنوز بیانشان شناخته شده نیست، در سطح آرایه وجود ندارند. علاوه بر این، برای ژنوم های بسیار متغیر مثل باکتری ها، آرایه ها معمولا با استفاده از اطلاعات ژنوم سویه ی مرجع طراحی می شوند. چنین آرایه هایی ممکن است بخش عمده ای از ژن های موجود در یک ایزوله مشخص از همان گونه را از دست بدهند. برای مثال، در گونه های باکتریایی Aggregatibacter actinomycetemcomitans محتوای ژنی تا 20% بین ایزوله های مختلف متفاوت است. بنابراین، آرایه ای که بر اساس حاشیه نویسی ژن از یک ایزوله مرجع تولید شده باشد، بسیاری از ژن هایی را که در سایر ایزوله ها وجود دارند را شناسایی نخواهد کرد.
کمپانی های مهم در زمینه ی میکرواری
در سال 2019، اندازه بازار جهانی میکرواری حدودا 4/1119 میلیون دلار بوده است و انتظار می رود که در انتهای سال 2026، ارزش این بازار به رقمی حدود 8/1243 میلیون دلار برسد که نشان دهنده افزایش علاقمندان به این فناوری می باشد. Affymetrix یکی از معروف ترین و محبوب ترین نام های تجاری عرضه محصولات DNA میکرواری می باشد که امروزه توسط کمپانی Thermo Fisher Scientific به فروش می رسد. شرکت Affymetrix، توسط استفان فودور در سال 1992 تاسیس شد و در سانتاکلارا کالیفرنیا مستقر است. در اواخر دهه ی 1980، این گروه روش های ساخت DNA میکرواری را تحت نام تجاری GeneChip affymetrix و با استفاده از تکنیک های ساخت نیمه هادی توسعه دادند. Illumina یکی دیگر از شرکت های معتبر در زمینه ی تولید چیپ های میکرواری می باشد. تکنولوژی میکرواری این شرکت از سیلیکا میکروبیدها استفاده می کند. این بیدهای سیلیکایی و کوچک با دقت درون چاهک هایی قرار داده شده اند و با کپی های متعددی از یک کاوشگر الیگونوکلئوتیدی پوشیده شده اند که بخش خاصی از ژنوم را هدف قرار می دهد. Agilent یکی دیگر از شرکت های پرطرفدار در زمینه ی میکرواری می باشد که یک رقیب تجاری مهم برای شرکت های Affymetrix و Illumina محسوب می گردد. این شرکت نیز یک شرکت آمریکایی می باشد که در سانتاکلارا کالیفرنیا واقع شده است. سه کمپانی ذکر شده معروف ترین کمپانی ها در زمینه ی میکرواری می باشند اما می توان به کمپانی های دیگری چون Roche NimbleGen، Sengenics، Arrayit، Applied Microarray، Biometrix Techonology، Savyon Diagnostic، Scienion AG و WaferGen که در این زمینه فعالیت می کنند نیز اشاره کرد.
پایگاه های داده میکرواری و ذخیره سازی داده ها
پایگاه های داده مخازنی برای ذخیره ی داده های متنوع می باشند. مهمترین اهداف این پایگاه های داده، ذخیره سازی داده های میکرواری بدست آمده از مطالعات مختلف، نمایه کردن داده ها با هدف قابل جستجو کردن آن ها و دسترسی دادن به سایر برنامه ها برای تحلیل و تفسیر داده ها می باشد. GEO معروف ترین پایگاه داده در زمینه ی میکرواری می باشد که در سال 2000 توسط NCBI (مرکز ملی اطلاعات زیست فناوری آمریکا) تاسیس گردیده است تا بدون هیچ محدودیتی و بدون نیاز به ثبت نام در سیستم، اجازه دسترسی رایگان به داده های ذخیره شده را به کاربران در سراسر جهان بدهد. در تاریخ نوشتن این متن، این پایگاه داده دارای داده های 4,402,599 نمونه بررسی شده است که حدود 2,275,246 نمونه آن، نمونه های انسانی می باشند. این داده ها دارای مضامین مختلف زیستی مثل بیماری، متابولیسم، تکامل، سم شناسی، ایمنی، محیط زیست، تراریخته و سایر موارد می باشند. داده های ارائه شده توسط ارسال کنندگان با سه موجودیت متفاوت یعنی پلتفرم، نمونه، و سلسله در GEO ذخیره می شوند. پلتفرم، شامل شرح مختصری از آرایه و جدول داده ای است که الگوی آرایه را تعریف می کند. هر سطر در جدول مربوط به یک عنصر است و شامل حاشیه نویسی توالی و اطلاعات ردیابی است که توسط ارسال کننده ارائه شده است. نمونه شامل شرح اطلاعات منبع زیستی (ارگانیسم، سن، جنس، بیماری و …) و پروتکل های آزمایشی استفاده شده برای آماده سازی نمونه است. سلسله، مجموعه ای از نمونه های مرتبط که بخشی از یک مطالعه هستند را در بر می گیرد و همچنین هدف کلی مطالعه و نحوه ی طراحی مطالعه را نیز شرح می دهد. اطلاعات مربوط به سه موجودیت ذکر شده با ترکیبی از روش های اتوماتیک و دستی به واحد های سطح بالاتری به نام GEO دیتاست تبدیل می شوند. دیتاست در واقع یک مجموعه از نمونه هایی است که به صورت مشابه پردازش شده اند و از نظر آزمایشگاهی به هم مرتبط هستند و خلاصه ای منسجم از یک مطالعه را ارائه می دهند.
ArrayExpress یکی دیگر از پایگاه های داده ی عمومی برای ذخیره سازی داده های میکراری است که توسط موسسه ی بیوانفورماتیک اروپا16 در سال 2002 تاسیس شده است و می توان آن را نسخه ی اروپایی GEO در نظر گرفت. ArrayExpress از استانداردها و توصیه های تهیه شده توسط انجمن داده های ژنومیکس عملکردی پشتیبانی می کند که یکی از این استانداردها تهیه ی حداقل اطلاعات در مورد یک آزمایش میکرواری و استفاده از زبان علامت گذاری میکرواریِ بیان ژن است. بالاترین سطح طبقه بندی داده در ArrayExpress، آزمایش نامگذاری شده است. یک آزمایش معمولا چندین روش سنجش مربوط به یک مطالعه یا نشریه را گروه بندی می کند. همچنین هر آزمایش شامل فراداده هایی می باشد که اطلاعات نمونه های زیستی، پروسه ی انجام آزمایش و فایل داده های آزمایش را در بر می گیرند. در تاریخ نوشتن این متن، 74,319 آزمایش مختلف در این پایگاه داده ذخیره شده اند. تعریف یک روش در این پایگاه داده به نوع آزمایش انجام شده بستگی دارد. برای آزمایش های مربوط به میکرواری، واژه روش نشان دهنده ی یک هیبریداسیون (از DNA نمونه زیستی به آرایه) می باشد. تمام داده ها و فایل های موجود در ArrayExpress توسط کاربران ارائه می شوند که یا مستقیما توسط کاربر به ArrayExpress ارائه می شوند و یا از پایگاه های داده ی دیگر مانند GEO به ArrayExpress وارد می شوند. بنابراین بخش زیادی از داده های GEO و ArrayExpress با یکدیگر همپوشانی دارند. داده هایی که به صورت مستقیم ارسال می شوند به صورت دستی بر آن ها نظارت می شود تا انطباق بیشتری با رهنمود های MIAME پیدا کنند.
کاربرد ها
1-تشخیص بیماری
محققان با استفاده از فناوری میکرواری می توانند اطلاعات زیادی در رابطه با بیماری های مختلف از جمله بیماری های قلبی، سرطان، بیماری های عفونی، بیماری های آلرژیک و … بدست آورند. در گذشته دانشمندان تومور ها را براساس اندامی که در آن تومور رخ می داد و گسترش پیدا می کرد، طبقه بندی می کردند. فناوری میکرواری این قابلیت را برای محققان فراهم کرده است تا با استفاده از الگو های بیان سکانس ها درون سلول های در حال رشد و همچنین بر اساس بیان ژن ها، این تومور ها را بیشتر و دقیق تر طبقه بندی کنند. پس از ایجاد این طبقه بندی ها، محققان می توانند روش های درمانی را که یک نوع خاص از تومور را هدف قرار می دهند به کار گیرند.
2- کشف دارو
با گذر زمان، حیطه شیمیِ پزشکی بیشتر و بیشتر از میکرواری استفاده می کند تا با استفاده از آن توالی های هدف کلیدی و شبکه های ژنی را که در تنظیم اثر بخشی دارو ها موثر هستند پیدا کند. از کاربردهای حیاتی فناوری DNA-میکرواری در زمینه ی مطالعات اثر بخشی و ایمن بودن دارو، می توان به استفاده از آن به عنوان یک ابزار غربالگری جهت شناسایی مسیرهای شیمیایی آلی، تعین مولکول های هدف بالقوه برای پزشکی مولکولی و شناسایی مکانسیم های مولکولی ایجاد سمیت ناشی از دارو و پیش بینی حساسیت و یا مقاومت یک فرد به دارو اشاره کرد.
3- تجزیه و تحلیل پزشکی دارویی
یکی از کاربردهای اصلی فناوری میکرواری در زمینه مطالعات سمیت عصبی، استفاده از آن به عنوان یک ابزار غربالگری برای شناسایی مکانیسم های مولکولی سمیت است. چنین رویکردهایی برای یافتن دسته ای از ژن ها و فرآورده های آن ها که مربوط به مکانیسم های ایجاد حساسیت یا مقاومت به مواد سمی هستند، استفاده می گردند.
داروهای گیاهی، که شامل انواع گونه های گیاهی می باشند، بخش مهمی از اقدامات پزشکی در طب سنتی به شمار می روند. همواره اثر بخشی گیاهان دارویی مورد شک و تردید بوده است که این امر تا حدی به دلیل دشواری کنترل کیفیت گیاهان و اجزای موثر آن ها می باشد. مکانیسم های عملکرد طب سنتی با بررسی ژن ها، مسیر های عملکردی مسئول و عملکرد سلول هایی که در ایجاد اثر دارو نقش دارند مشخص می شود. امروزه فناوری میکرواری با بررسی ژن ها و مسیر های دخیل در عملکرد درمانی طب سنتی، نقش مهمی در رفع شک و تردید ها در اثر بخشی این درمان ها ایفا می کند.
4- شناسایی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی
شناسایی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی در یک جمعیت خاص و یا در جمعیت های مختلف یکی از کاربردهای مهم میکرواری می باشد. برای کاربرد هایی از قبیل تعیین ژنوتیپ، تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی، سنجش استعداد ابتلا به بیماری، شناسایی کاندیدا های دارویی، ارزیابی جهش های ژرم لاین در افراد یا جهش های سوماتیک در سرطان ها، ارزیابی از دست دادن هتروزیگوتی (LOH) و یا تجزیه و تحلیل ارتباط ژنتیکی، می توان از میکرواری شناسایی کننده ی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی استفاده کرد.
5- آنالیز های اتصال فاکتور های رونویسی
فاکتورهای رونویسی (TF) سکانس هایی خاصی را در نواحی تنظیمی DNA شناسایی کرده و به آن متصل می شوند؛ این نواحی تنظیمی را نواحی اتصالی فاکتورهای رونویسی (TF-BS) می نامند. اتصال فاکتورهای رونویسی به TF-BS ها در نهایت برنامه تنظیمی سلول را که در زمان تقسیم، تکامل، پاسخ به محرک های محیطی و … اعمال می شود را مشخص می کنند.
میکرواری در ترکیب با تکنیک رسوب ایمنی کروماتین می تواند برای تعیین مکان های اتصال عوامل رونویسی استفاده گردد. به این روش ChIP-chip می گویند که به معنی ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتین روی یک چیپ میکرواری است. در این روش فاکتورهای رونویسی به کمک فرمالدئید به DNA هدف متصل می شوند و سپس DNA قطعه قطعه می شود. فاکتورهای رونویسی مورد هدف (همراه با DNA ای که به آن متصل بودند) با استفاده از آنتی بادی ضدفاکتور رونویسی، به وسیله ی کروماتوگرافی تمایلی جدا می شوند. بعد از خالص سازی، DNA از فاکتورهای رونویسی جدا می شود، نسخه های آن تکثیر و برچسب گذاری می شود و سپس با آرایه هیبرید می شود.
6- تشخیص پیرایش متناوب RNA
پیرایش متناوب RNA فرآیندی است که در آن یک ژن منفرد می تواند چندین پروتئین را کد کند. در این فرآیند، اگزون های خاصی از یک ژن ممکن است از ساختار mRNA بالغ حذف شوند و یا در آن باقی بمانند. این فرآیند باعث می شود که اگزون ها با ترکیب های متفاوتی به یکدیگر متصل شوند و رشته های mRNA متفاوتی ایجاد می کنند که در نهایت پروتئین های متفاوتی را کد می کنند.
در میکرواری طراحی شده برای تشخیص اتصالات اگزونی، از کاوشگرهایی استفاده می شود که مخصوص مکان های بالقوه و مورد انتظار برای مکان های پیرایش یک ژن هستند. از این روش برای سنجش بیان فرم های مختلف پیرایش یافته از یک ژن استفاده می شود. میکرواری اگزونی، طراحی متفاوتی دارد و از کاوشگرهایی استفاده می کند که برای تشخیص هر اگزون منفرد از یک ژن شناخته شده یا پیش بینی شده طراحی شده اند و می توانند برای تشخیص ایزوفرم های مختلف پیرایش یافته استفاده شوند.
7- تعیین مقاومت به داروهای ضد میکروبی
امروزه طیف وسیعی از تشخیص های مولکولی معمول، مثل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) وجود دارند. PCR گزینه ی مناسبی برای تعیین و تشخیص یک ژن و یا تعداد محدودی از ژن ها به صورت همزمان می باشد. اما زمانی که بخواهیم تعداد زیادی از ژن ها را به صورت همزمان شناسایی کنیم، مثل ژن هایی که در مقاومت به داروهای ضد میکروبی نقش دارند، PCR به دلیل زمانبر بودن گزینه ی مناسبی نخواهد بود. بنابراین برای تعیین مقاومت دارویی، روش هایی مثل میکرواری که یک روش مقرون به صرفه از نظر اقتصادی و مناسب برای شناسایی سریع طیف وسیعی از ژن ها به طور همزمان می باشد، می تواند جایگزین مناسبی باشد.
آنالیز داده های میکرواری
1- پردازش تصویر
پس از انجام مراحل آزمایشگاهی و هیبریداسیون، اولین مرحله ی آنالیز داده، اسکن کردن آرایه و استخراج داده ی خام از شدت نور فلورسنت ناشی از هیبریداسیون می باشد. در تصویر برداری و پردازش تصویر چهار مرحله ی کلی وجود دارد:
- الف) اسکن کردن
- ب) شناسایی نقاط و شبکه بندی
- ج) تقسیم بندی
- د) استخراج شدت و محاسبه ی نسبت ها.
الف) اسکن کردن: زمانی که تصویر آرایه اسکن می شود تمام داده ها، چه با کیفیت و چه بی کیفیت، ثبت می شوند. تصویر بی کیفیت نیازمند دست ورزی های بیشتری است که باعث کاهش قدرت آنالیز (کاهش قدرت شناسایی نقاط و تمایز پیکسل ها و استخراج شدت هر نقطه) در مراحل بعدی می شود. دو پیش شرط برای بدست آوردن یک تصویر با کیفیت بالا وجود دارد: اولا باید تمام مراحل استخراج RNA، ساخت آرایه، برچسب گذاری و هیبریداسیون آرایه با بالاترین استاندار های ممکن انجام شود؛ این پیش نیاز باعث می شود که آلودگی ها (مثل گرد و غبار یا خاک) کمترین میزان تاثیر را بر تصویر بگذارند و همچنین نقاطی با بیشترین نسبت سیگنال به نویز در تصویر ایجاد شوند، دوما انتخاب پارامتر های اسکن مثل قدرت لیزر، وضوح تصویر و تنظیمات لوله PMT بسیار مهم است.
ب) شناسایی نقاط و شبکه بندی: تشخیص و یا شبکه بندی نقاط برای اکثر نرم افزار های امروزی تجزیه و تحلیل تصویر مسئله ی دشواری نیست، اگرچه برای برخی نقاط تنظیم شبکه بندی به صورت دستی لازم می باشد. در حقیقت بسیاری از محققان ترجیح می دهند به فرآیند تنظیم شبکه و علامت گذاری نقاط کم کیفیت تصویر که توسط نرم افزار انجام شده است کاملا اطمینان نکرده و آن را مجدد به صورت دستی مورد بازرسی قرار دهند.
ج) تقسیم بندی: تقسیم بندی فرآیندی است که برای تمایز پیکسل های پیش زمینه (یعنی سیگنال های واقعی) در یک نقطه شبکه بندی شده از پیکسل های پس زمینه استفاده می شود. برای تقسیم بندی الگوریتم های مختلفی نظیر الگوریتم دایره ثابت، تقسیم بندی دایره تطبیقی، تقسیم بندی شکل تطبیقی و تقسیم بندی هیستوگرام وجود دارد همچنین الگوریتم های مختلفی مانند الگوریتم پس زمینه ثابت و الگوریتم پس زمینه ناحیه ای برای محاسبه ی پیکسل های پس زمینه وجود دارند. انتخاب الگوریتم مناسب برای تقسیم بندی و محاسبه ی پس زمینه به کیفیت تصویر خام گرفته شده بستگی دارد.
د) استخراج شدت و محاسبه ی نسبت ها: پس از فرآیند تقسیم بندی، نرم افزار شدت پیکسل را در مناطقی از تصویر به عنوان پیش زمینه و پس زمینه، به طور میانگین و جداگانه، مشخص می کند تا شدت پیش زمینه و پس زمینه از آن ها محاسبه گردد. در صورت وجود مقادیر بسیار زیاد در نقاط، که باعث ایجاد چولگی (معیاری برای تعیین نرمالیتی در توزیع داده ها می باشد) در توزیع شدت پیکسل ها می شود، می توان از روش میانه یا سایر روش های استخراج شدت استفاده کرد. تفریق شدت پس زمینه از شدت پیش زمینه در هر کانال، شدت هر نقطه را برای محاسبه ی نسبت بیان بین دو کانال مشخص می کند.
2- مراحل پیش پردازش و نرمال کردن داده ها
پس از مراحل تجزیه و تحلیل تصویر، باید مراحل پیش پردازش بر روی داده های استخراج شده صورت گیرد تا نقاط بی کیفیت از ادامه ی آنالیز ها حذف شوند. همچنین این داده ها باید نرمال سازی شوند تا بسیاری از خطاهای سیتماتیک را قبل از آنالیزهای پایین دست حذف کنیم. هر نقطه که شدت رنگ کمتر از دو انحراف معیار از پس زمینه داشته باشد، باید حذف شود. همچنین نسبت شدت ها باید به مقیاس لگاریتمی تبدیل شود تا مقادیر افزایش بیان یافته و کاهش بیان یافته مقیاس یکسان داشته باشند و قابل مقایسه باشند.
فرآیند نرمال کردن داده ها با هدف حذف خطاهای سیستماتیک به وسیله ی ایجاد تعادل در شدت فلورسنس دو رنگ برچسب شده انجام می شود. تفاوت در شدت رنگ ها می تواند منشاء های مختلفی از جمله تفاوت در موثر بودن برچسب گذاری رنگ ها، حساسیت به گرما و نور و همچنین تنظیمات اسکنر برای اسکن کردن دو کانال باشد. برخی روش های معمول برای محاسبه ی میزان نرمال سازی عبارتند از:
(1) نرمال سازی سراسری؛ که از همه ی ژن های آرایه استفاده می کند.
(2) نرمال سازی ژن های خانه دار (housekeeping genes)؛ که از ژن های خانه دار (مانند ژن اکتین، بتا-2-میکروگلوبولین و …) که بیان ثابتی دارند استفاده می کند
(3) نرمال سازی کنترل های خارجی که از مقادیر مشخصی از ژن های کنترل خارجی که طی هیبریداسیون اضافه شده اند استفاده می کند.
متاسفانه این روش های نرمال سازی کافی نیستند زیرا تفاوت رنگ ها می تواند به عواملی مانند شدت نقاط و مکان فضایی روی آرایه نیز بستگی داشته باشد. در نتیجه استفاده از نرمال سازی ژن های خانه دار، ممکن است منبع خطا احتمالی دیگری را ایجاد کند. امروزه روش دیگری به نام روش نرمال سازی غیر خطی بر اساس شدت و اطلاعات مکانی ارائه شده است، که اعتقاد بر این است که از سایر روش ها برتر است.
3- تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA)
تحلیل مولفه های اصلی (Principal component analysis (PCA)) یک روش معمول برای تجزیه و تحلیل داده های بیان ژن در روش میکرواری است که اطلاعاتی را در رابطه با ساختار کلی دیتاست مورد تجزیه و تحلیل به ما می دهد. PCA بدون هیچگونه نظارتی، اطلاعاتی را در رابطه با جهت غالب واریانس (تفاوت) در داده ها مشخص می کند و می تواند میزان شباهت و تفاوت بین نمونه های مختلف را نشان دهد و همچنین برای خوشه بندی متغیر های مورد مطالعه استفاده شود. سپس اطلاعات مربوط به همولوژی نمونه ها با حاشیه نویسی و اطلاعات فنوتیپی مقایسه می شوند تا نمونه هایی که فاقد حاشیه نویسی مناسب بوده اند مشخص شوند. در بیشتر مطالعات، محققان بر روی دو و یا چهار PC اول تمرکز می کنند، چرا که این اجزا بیشترین واریانس بین نمونه ها را در بر می گیرند (برای مثال PC اول نشان دهنده ی بیشترین تفاوت در نمونه ها می باشد و PC دوم و سوم و … به ترتیب در مرتبه های بعدی قرار می گیرند.) و PC هایی که در مراتب بعدی هستند اغلب حاوی اطلاعات غیر مرتبط و یا نویز می باشند.
4- تعیین ژن های افتراقی
مرحله ی بعد آنالیز ها، استفاده از تکنیک های آماری و استخراج ژن هایی با بیان افتراقی (Differentially expressed genes (DEGs)) در مطالعه می باشد. به صورت سنتی، ژن های افتراقی با حد آستانه ی ثابت (به عنوان مثال افزایش بیان یا کاهش بیان دو برابر) مشخصمی شوند، اما این روش از نظر آماری ناکارآمد است، زیرا تغییرات سیستماتیک و زیستی زیادی وجود دارند که در طی یک آزمایش میکرواری رخ می دهند. اگرچه برخی از تغییرات سیستماتیک مانند گرایش رنگ با نرمال سازی به طور موثری برطرف می شود، اما برطرف کردن تغییرات زیستی تصادفی مثل تفاوت های موجود در هر نمونه نسبت به نمونه دیگر و یا تغییرات فیزیولوژیکی دشوارتر است. به دلیل وجود این تغییرات اساسی، صرف استفاده از یک حد آستانه ی ثابت برای تعیین ژن های افتراقی کافی نیست و باعث افزایش نسبت مثبت و منفی کاذب می شود. بنابراین یک چارچوب بهتر در این زمینه، استفاده از محاسبه ی آماری برای تعیین بیان متفاوت ژن ها بین گروه های دخیل در مطالعه می باشد تا علاوه بر تغییر بیان، حد آستانه ای برای رد فرضیه ی صفر وجود داشته باشد.
تست های آماری مثل Student’s t-test و تست های دیگری چون ANOVA یا Mann-Whitney برای رتبه بندی ژن ها در داده های حاصل از تکرار ها می توانند استفاده شوند. تعیین حد آستانه P_value برای ژن های افتراقی مشکل است زیرا شخص باید تعادلی در میزان مثبت کاذب (خطای نوع یک) و منفی کاذب (خطای نوع دو) ایجاد کند. علاوه بر این، تکرار یک تست آماری برای ده ها هزار ژن، می تواند مشکل آزمایش فرضیه چندگانه را ایجاد کند. برای مثال در یک آزمایش با یک آرایه ی 10.000 ژنی که سطح معنادار بودن α برابر با 0.05 در نظر گرفته شده باشد، تفاوت 500 ( 0.05×10.000) معنادار استنباط خواهد شد حتی اگر در واقعیت هیچ یکاز ژن ها در گروه های مورد مطالعه تغییر بیان معناداری نداشته باشند. بنابراین استفاده از P_value برابر با 0.05 احتمال وقوع خطای نوع یک را افزایش می دهد (افزایش مثبت کاذب). مشکل آزمایش فرضیه چندگانه با استفاده از روش های تعدیل P_value برطرف می شود. روش های مختلفی برای تعدیل P_value وجود دارد که از معروف ترین آن ها به روش های بنجامین هاچبرگ (Benjamin Hochberg)، تصحیح Bonferroni، روش Holm-Bonferroni و FDR می توان اشاره کرد. FDR روش توصیه شده می باشد و معمولا برای تعدیل P_value در مطالعات میکرواری استفاده می شود. البته باید توجه کرد که تعدیل P_value می تواند بسیار سختگیرانه باشد و قدرت شناسایی ژن هایی را که به طور قابل ملاحظه بیان متفاوت دارند را محدود می کند. در شرایطی که اکثریت موارد مثبت حقیقی انتخاب شده باشند، وجود چند مورد مثبت کاذب قابل قبول می باشد. همچنین برای تایید نهایی بیان متفاوت ژن ها در یک مطالعه میکرواری (و تعیین مثبت کاذب بودن یا نبودن) از تکنیک هایی مثل واکنش زنجیره ای پلیمراز (RT-PCR) و نورتن بلات می توان استفاده کرد.
ژن های افتراقی به دست آمده از آنالیز میکرواری را می توان با نمودارهای مختلفی نمایش داد. یکی از بهترین نمودار ها در این زمینه، نمودار آتشفشانی (volcano plot) می باشد. در این نمودار محور افقی نشان دهده ی لگاریتم چند برابری در مبنای 2 و محور عمودی نشان دهنده ی منفی لگاریتم P_value تعدیل شده در مبنای 10 می باشد.
5- آنالیز مسیرهای بیولوژیکی
در یک سیستم زیستی، ژن ها هرگز به تنهایی عمل نمی کنند و به صورت شبکه ای و در ارتباط با یکدیگر عمل می کنند. در نتیجه آنالیز نتایج بدست آمده از میکرواری با دیدگاه بررسی مسیرهای بیولوژیکی، می تواند به سطح بالاتری از درک سیستم منجر شود. رویکردهای جالبی در این زمینه وجود دارد. یکی از رویکردهای معمول به این شکل است که ژن هایی که در یک گروه خوشه بندی می شوند، ممکن است با یکدیگر تنظیم شوند و یا در یک مسیر سیگنالینگ مشترک عمل کنند. آنالیز پروموتر این گروه از ژن ها، اغلب موتیف های تنظیمی مشترک را نشان می دهد و همچنین سطح بالاتری از سازماندهی شبکه را در سیستم زیستی رونمایی می کند. رویکرد دیگر، مطالعه مسیر هایی است که ژن های افتراقی حاصل از آنالیز داده ها در آن دخیل هستند. در این دسته آنالیزها که به آنالیز غنی سازی مسیر معروف هستند، ژن های معرفی شده از نظر حضور معنا دار در مسیر های زیستی مختلف سنجیده می شوند و نتایج به صورت P_value گزارش می شوند. از معروف ترین پایگاه های داده در این زمینه، می توان به KEGG، Reactome، و WikiPathways اشاره کرد.
